| 研究課題/領域番号 |
25861349
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 独立行政法人国立長寿医療研究センター |
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研究代表者 |
上住 円 (池本 円) 独立行政法人国立長寿医療研究センター, 再生再建医学研究部, 室長 (70435866)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 老化 / 骨格筋 / 幹細胞 |
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| 研究概要 |
サルコペニア（加齢に伴う筋量および筋機能の低下）の原因には未だ不明な点が多いが、加齢に伴う筋再生能力の低下が一因であると考えられている。成体筋組織の再生は、骨格筋特異的な幹細胞である筋衛星細胞が担っており、我々はこれまで、筋衛星細胞数が加齢に伴い顕著に減少することを明らかにしている。また、老齢マウス (24ヶ月齢超) と若齢マウス (2-3ヶ月齢) の筋衛星細胞を用いた網羅的遺伝子発現解析から、加齢に伴い筋衛星細胞で発現変動する遺伝子を同定している。本研究では、これらの変動遺伝子のうち、加齢に伴い筋衛星細胞で発現が減少するNGFR (Nerve Growth Factor Receptor) に着目し、その機能解析から加齢に伴う筋衛星細胞数減少機序を明らかにする。まず、個々の筋衛星細胞レベルでNGFRの発現を調べると、NGFRは若齢マウスにおいても全ての筋衛星細胞で発現しているわけではなく、NGFR(+)とNGFR(-)筋衛星細胞が存在しており、老齢マウスではNGFR(+)筋衛星細胞の割合が顕著に低下していることが明らかとなった。そこで、若齢マウスを用いて下肢骨格筋からNGFR(+)とNGFR(-)筋衛星細胞を分取し、in vitroでその機能を比較したところ、NGFR(+)筋衛星細胞に比べNGFR(-)筋衛星細胞では著しい増殖能の低下が認められた。また、若齢マウスから分取したNGFR(+)筋衛星細胞の培養中にNGFRのリガンドの1つであるNGFを添加すると増殖が促進されたことから、筋衛星細胞の機能におけるNGFRシグナリングの重要性が示唆された。今後、より詳細な機能解析を行い、加齢による骨格筋幹細胞数減少機序の解明を目指す。この研究成果は、サルコペニアの発症機序の解明および骨格筋幹細胞数の維持によるサルコペニアの予防法開発につながると期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、加齢に伴い筋衛星細胞で発現が顕著に減少するNGFRに着目し、その機能解析を介して、加齢に伴う筋衛星細胞数減少機序を探る。若齢マウスにおいても一部の筋衛星細胞がNGFR(-)であることから、平成25年度は、主に若齢マウス (2-3ヶ月齢) を用いて、下肢骨格筋からNGFR(+)およびNGFR(-)筋衛星細胞を別々に分取し、in vitroでそれらの細胞の能力を比較することが目的であった。そのためにまず、NGFR(+)とNGFR(-)筋衛星細胞の増殖能を比較し、NGFR(-)筋衛星細胞では著しく増殖能が低下することを明らかにした。また、NGFR(+)筋衛星細胞の培養中にリガンドを添加することにより増殖が促進されたことから、筋衛星細胞の機能におけるNGFRシグナリングの重要性も確認できた。このように、おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成26年度以降は、若齢マウスから分取したNGFR(+)とNGFR(-)筋衛星細胞を用いて、in vitroとin vivoの両方から筋衛星細胞の生存維持や機能におけるNGFRの役割を明らかにする。
(1) NGFR(+)とNGFR(-)筋衛星細胞の機能比較：それぞれの細胞を筋ジストロフィーのモデルマウスであるmdxマウス（ジストロフィンを欠損している）の対足に移植し、ジストロフィン染色により移植したNGFR(+)およびNGFR(-)筋衛星細胞の筋再生能力を比較する。
(2) 筋衛星細胞の機能におけるNGFRシグナリングの重要性の検証：NGFR(+)筋衛星細胞の培養中にNGFR-Fc融合タンパク質を添加し、NGFRシグナリングの阻害が筋衛星細胞の機能に及ぼす影響を調べる。さらに、若齢マウスの下肢骨格筋に筋損傷を誘導後、NGFRのリガンドまたはNGFR-Fc融合タンパク質を投与し、NGFRシグナリングの活性化または阻害による筋再生への影響をin vivoで検証する。
(3) 筋衛星細胞特異的にNGFRを欠損させたコンディショナルKOマウスの作製および解析：骨格筋において筋衛星細胞特異的に発現するPax7の制御下でタモキシフェン誘導型Creを発現するマウス (Pax7-CreERT2) とCreの作用によりNGFRが欠損するflox (NGFRFloxed/Frt) マウスを交配し、タモキシフェン投与により筋衛星細胞特異的にNGFRを欠損するコンディショナルKOマウスを作製する。このマウスにおける筋衛星細胞数の変動を、Pax7またはM-cadherin (筋衛星細胞のマーカー) 抗体を用いた免疫組織染色やFACSによって定量し、NGFRの欠損が筋衛星細胞の生存維持に及ぼす影響を調べる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
筋衛星細胞におけるNGFRの機能解析について、in vitroでの検証はおおむね予定通りに進展しているが、NGFR-Fc融合タンパク質を用いた阻害実験のみ現在進行中であるため、その購入費用を次年度使用額とした。また、筋衛星細胞特異的にNGFRを欠損させたコンディショナルKOマウス作製に関して、マウスの購入が遅れているため、その費用を次年度使用額とした。
上述した今後の研究の推進方策の内容に加えて、NGFR-Fc融合タンパク質を用いたin vitroでの阻害実験のために使用する。また、コンディショナルKOマウスの作製に用いるマウスの入手のために使用する。
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