| 研究課題/領域番号 |
25861444
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
岩月 正一郎 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 臨床研究医 (70595397)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 精子形成 / 遺伝子導入 / siRNA / Numb / Numb-like / 精細胞 |
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| 研究概要 |
1.ラット精巣へのsiRNA発現ベクターの導入とその効果
①正常ラット精巣におけるNumbおよびNumb-likeの発現局在の解析を蛍光抗体を用いた免疫組織化学にておこなった。その結果、NumbおよびNumb-likeは精祖細胞から精子細胞までの精細胞に発現しており、Numbは精子細胞ではNumb-likeに比較して発現量が相対的に減少することがわかった。また週齢ごとによるNumbおよびNumb-likeの発現量の推移を、4～12週齢の正常ラットを用いて定量PCR法にて解析した。その結果、Numbは週齢を経るにつれて減少する一方、Numb-likeは精子形成が始まる6週齢でピークとなることがわかった。
②次に、NumbおよびNumb-likeに対するsiRNA発現ベクターをデザイン、構築した。NumbおよびNumb-likeに対するsiRNAの配列をソフトウェアを用いて、それぞれ3種類ずつ作成した。このsiRNAを発現するDNAを、ベクタープラスミド(pcDNA TM6.2-GW/EmGFP-miR)にインサートし、siRNA発現ベクターを作成した。NumbおよびNumb-likeそれぞれに対してもっとも発現抑制効率の高いベクターを選定するため、NRK-52E細胞にベクターを遺伝子導入し、NumbおよびNumb-likeの発現変化を調べた。
③以上で構築したベクタープラスミドをTOP10をcompitent cellとして、LB培地にて大量に培養・増幅をおこなった。増幅したベクタープラスミドは、ベクター抽出キットを用いてin vivo遺伝子導入に向けて調整した。
④増幅したベクタープラスミドを、トリパンブルーで着色したPBSに溶解し、ラット精巣にin vivo導入を開始し、現在継続中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、遺伝子機能の解析に先立ち、正常ラット精巣における発現の局在と週齢における変化を検討した。また、in vivoで機能抑制実験に用いるためのベクタープラスミドを構築し、増幅しながら現在順次ラット精巣に導入を開始している。現在、導入効率に関して、その条件設定に課題を残す形とはなったが、機能解析の対象となる遺伝子の発現パターンの解析と、ベクタープラスミドの構築を行い、in vivo遺伝子導入を開始することができたため、おおむね順調に進んでいるとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、平成25年度に構築したベクタープラスミドの増幅を繰り返しながら、ラット精巣にin vivo導入をさらに進めていく予定である。しかし、導入効率を向上するために種々の条件設定をする必要があるため、さまざまな条件を設定しながら至適条件を決定する予定である。
至適条件の決定の後、実際にNumbおよびNumb-likeの機能喪失による影響を、組織学的、分子生物学的に評価する予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度に行った研究のうち、ベクタープラスミドの増幅とin vivo遺伝子導入を平行して開始したため、ベクター増幅に伴う費用が主に次年度繰越となったため。
ベクタープラスミド増幅にかかる費用に主に使用し、その他分子生物学的検索のための試薬の購入に使用予定である。
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