研究課題/領域番号 |
25861599
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研究種目 |
若手研究(B)
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研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
研究代表者 |
吉岡 哲志 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (20648539)
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研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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キーワード | 虚血性難聴 / 骨髄由来間葉系幹細胞 / 内耳再生 |
研究概要 |
マウス由来骨髄由来間葉系幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cell; BMSC)およびマウス胚性幹細胞(Embryonic stem cell; ES)にTLX3を強制発現させ、その定常発現株を選択した。Mammalian expression vector として、Takara pBApo-EF1α Neoを用い、そのmulti cloning siteに3xFLAG+Tlx3 geneをcloningした。マウスBMSCとマウスES細胞株(EB5)に、上記のvectorをlipofection法により導入し、その後Tlx3発現株を薬剤性にselection後、継代を重ね、Tlx3の安定発現株を選択した。8継代まで進めた後、neomycin耐性を持つ6クローンをanti-Tlx3 antibobyでWestern blotした所、Tlx3を定常的に発現しているクローンが1つ確認された。 現在Tlx3定常発現ES細胞(EB5-Tlx3)とコントロールES細胞(EB-5.pBApo)について、SFEB法(serum-free floating culture of embryoid body-like aggregate)を用いて神経系に分化誘導した際に、Tlx3を強制発現させた場合とそうでない場合での遺伝子発現変化をDNAchipを用いて検討をするための準備を開始している。DNAchipを用いた遺伝子発現解析により、ES細胞を神経系に分化誘導する際に、Tlx3を強制発現させた時の遺伝子変化を網羅的に解析する予定である。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
骨髄由来間葉系幹細胞の神経系への分化誘導が最近血清を変えたことにより、以前のように効率的に作成出来なくなっている。この解決策として、現在血清のlotチェックを行い、効率的に神経系への分化誘導が可能な血清を選択するように努力している。また場合によっては、SFEB法(serum-free floating culture of embryoid body-like aggregate)のように血清を用いない方法に切り替えて研究を行うことも検討している。但し、SFEB法を用いた場合には骨髄由来間葉系幹細胞の代わりに胚性幹細胞だけを用いて検討することになる。
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今後の研究の推進方策 |
研究実績の概要でも述べたように、骨髄由来間葉系幹細胞やES細胞を神経系に分化誘導する際に、Tlx3を強制発現させた時の遺伝子変化を網羅的に解析する予定である。
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次年度の研究費の使用計画 |
骨髄由来間葉系幹細胞の神経系への分化誘導が最近血清を変えたことにより、以前のように効率的に作成出来なくなっている。この解決策として、現在血清のlotチェックを行い、効率的に神経系への分化誘導が可能な血清を選択しようとしている。この為実験がやや足踏み状態となっている。 骨髄由来間葉系幹細胞を神経細胞へ効率的に分化誘導できる血清が選択できれば、研究をペースを上げて続行する。またもし神経分化効率の良い血清を選択できなければ、SFEB法(serum-free floating culture of embryoid body-like aggregate)の様に血清を用いない方法に切り替えて研究を行うことも検討している。但し、SFEB法を用いた場合には骨髄由来間葉系幹細胞の代わりに胚性幹細胞だけで検討することになる。
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