| 研究課題/領域番号 |
25861640
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
井上 みゆき 熊本大学, 生命科学研究部, 特任助教 (20631766)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 線維柱帯細胞 / TGF-β2 / 緑内障 |
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| 研究概要 |
房水流出に関与するRho-ROCKシグナル、緑内障患者房水中に存在するTGF-β2や炎症性サイトカインの相互作用を明らかにするため、平成２５年度はヒト線維柱帯細胞を購入後、培養し、始めにTGF-β2添加後のRho-ROCKシグナルの活性化について検討した。TGF-β2添加後、タンパクを回収しRhoAの活性化についてpull-downアッセイ法にて調べた。その結果、TGF-β2 2.5ng/ml添加後、RhoAの活性化が生じていた。さらにWestern blot法にてRho-ROCKシグナルの下流のMLC2のリン酸化を調べた結果、MLC2リン酸化レベルが有意に上昇し、その発現はROCK阻害剤によって阻害された。F-actinに結合するphalloidinを用い、細胞内局在についても調べたところ、TGF-β2添加によってアクチン重合が観察され、ROCK阻害剤によってその効果は阻害された。よってヒト線維柱帯細胞において、TGF-β2シグナルによってRho-ROCKシグナルが活性化していることが示唆された。さらに、細胞外マトリックスのタンパク発現、mRNA発現、転写活性化について調べた。細胞外マトリックスの一つであるI型コラーゲンについて検討した結果、TGF-β2添加後にタンパク発現が有意に上昇していた。またreal-time RT-PCR法によってmRNAの発現も調べたところ、同様の結果が観察された。さらにプロモーターアッセイによって転写活性についても調べた結果、TGF-β2添加後、転写活性が有意に上昇していることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒト線維柱帯細胞を用いての実験系が確立され、TGF-β2シグナル下におけるRho-ROCKシグナルの活性化および細胞外マトリックスの一つであるI型コラーゲンのタンパク発現、mRNA、転写活性について結果が得られている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２５年度で達成できなかった実験をまず行う。また結果が明らかになった現象を元に平成２６年度計画に基づいて、線維柱帯細胞内におけるシグナル伝達について調べる。まずTGF-β2シグナルの下流の転写因子Smad2/3、炎症性サイトカインの下流シグナルp38、NF-kβ経路の活性化について検討する。さらにサイトカインIL-6の下流の転写因子STAT3活性化についても調べ、TGF-β2とサイトカインがどのように協調的に機能するかについて調べる。また阻害剤を用いて、上記においてシグナルの抑制効果についても調べる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
申請者が産前産後休暇、育児休暇を４か月取得し、その間実験を中断しており、試薬等の購入等が減り、次年度に繰り越すこととなった。
本研究で使用するヒト線維柱帯細胞、またサルの眼球は高額のため、その購入に充てる。また試薬、特に抗体が高額なため、その購入に使用することとする。
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