| 研究課題/領域番号 |
25861650
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
宮下 英之 慶應義塾大学, 医学部, 特任助教 (60424173)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 幹細胞ニッチ / 角膜輪部上皮 / 角膜上皮幹細胞 / メラノサイト |
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| 研究概要 |
我々は初代培養ヒト角膜輪部上皮シートにメラノサイトを見出したことから、メラノサイトまたはメラノサイト幹細胞が上皮細胞のニッチとして働いているとの仮説を立て、これを検証している。まず、生体ヒト角膜輪部にメラノサイト幹細胞が存在するか確認するため、メラノサイト系譜の転写因子であるMITFとメラノサイトマーカーであるMART-1の2重染色を行った。その結果、上皮基底層直下に存在するメラノサイトの一部に、MITF陽性、MART1陰性の細胞を見出した。このことは、輪部におけるメラノサイト幹細胞の存在を示唆する。また、上皮長期培養系におけるメラノサイトの局在を確認した。初めの5か月培養上皮シート1例ではメラノサイトを検出できなかったものの、別ロットの6か月培養上皮シートではWhole mount stainingを用いることで、3例中3例でメラノサイトを確認できた。これらのメラノサイトは生体と同じく上皮基底層に局在した。次にメラノサイト添加により培養上皮細胞の未分化細胞が増加するか検討した。まずメラノサイト培養の条件検討を行い、市販培地にSCFとET3を追加することで、培養メラノサイトの増殖が顕著に刺激されることを見出した。そこで、この条件で培養したメラノサイトを生体輪部より分離した上皮細胞と共培養したが、未分化細胞マーカーの染色性自体は良いものの、予想に反し重層上皮が2層、増殖したメラノサイトの上下に侵入して挟み込むIrregularな形態を示した。また培養メラノサイトはRT-PCRではメラノサイトマーカーの発現を示したものの、免疫染色では一部の細胞のみがメラノサイトマーカー陽性であった。そこで、計画を前倒ししてFACSでの新鮮メラノサイト分離に切り替え、現在分離メラノサイトと上皮の共培養を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までのデータは、予想通りメラノサイト幹細胞が生体及び培養上皮に存在する可能性を示す。また、予想に反して培養メラノサイトの純度が低く、またその状態のメラノサイトと共培養した上皮はIrregularな形態を示すものの、FACSによる新鮮輪部組織からの純化と共培養を前倒しすることで計画全体としてはおおむね順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はFACSで分離したメラノサイトと上皮との共培養系による検討を中心に進める。なおメラノサイト培養については、University College London Institute of Ophthalmology のDaniels博士のラボより純度の高い培養法を学んでおり、今後応用予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究費の合理的使用のため。
本年度分895円を次年度予算と統合し、より効率的な予算運用を行う。
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