| 研究課題/領域番号 |
25861657
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
上野 宏樹 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (30529897)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 角膜stem/progenitor細胞 / 角膜三叉神経 / 炎症細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では角膜幹細胞が生体内で生存、機能していく上で、炎症は重要な阻害因子であるという仮説の下、マウス角膜炎症モデルを用いてそのメカニズムを詳細に解明していくことを目的としている。マウス角膜炎症モデルを用いた幹細胞の機能解析として、角膜にナイロン糸を縫合し炎症を惹起させ、術後経時的に角膜を採取し、フローサイトメトリー、免疫組織化学、Real-time PCRの手法を用いて幹細胞の定量・機能解析を行う。
詳細な研究方法としては、C57BL/6マウス角膜に11-0ナイロンを3針通糸し角膜内に炎症を惹起させ、術後7、14日目に角膜を採取する。また角膜内の炎症が沈静化した後の幹細胞の変化を検討するために、11-0ナイロン糸を通糸し、７日後に抜糸、抜糸後７日目の角膜も比較のために同時に検討した。まず角膜炎症モデルマウスにおける角膜三叉神経をβIII-tubulinにて免疫染色を行った結果、正常眼と比較して特にsub-basal nerveの層の神経密度が減少し、また形状においても屈曲・途絶の著しい減少が観察された。更に角膜幹細胞の測定としては、角膜（各n=6）をコラゲナーゼ処理し、角膜細胞を単一化させ、その単一化した細胞を、Hoechst33342で染色し、side populationを フローサイトメーターにて解析した。また、炎症細胞を除くためにCD45を同時染色し、CD45(-)細胞のSPの割合も検討した。術後7,14日目とも正常角膜のside populationに比べて約80%と著しく減少している結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2014年度に、炎症惹起時またその後の状況における幹細胞の蛋白定性・定量分析を行い、その結果を踏まえて炎症が角膜三叉神経と角膜stem/progenitor細胞の両方に影響することを国内外学会において発表する予定であったが、定性分析の結果、特に免疫染色において鮮明な結果を提出できず、再度至適条件を模索している。またフローサイトメトリーによる角膜縫合糸設置後、抜糸後の安定した定量条件の見直しを行っているため、計画を変更し他の角膜幹細胞マーカーの解析を行うこととしたためやや達成度が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、フローサイトメトリーもしくはウェスタンブロット法を用いて、マウス角膜に縫合糸設置後、抜糸後の安定した角膜幹細胞定量条件の見直しを行いながら、他の角膜幹細胞マーカーの解析も行う等計画を変更しながら再検討している。また免疫染色においても同様に他の角膜幹細胞マーカーにおいて代替できるかを模索していく。 引き続いて、活性化したマクロファージの存在が角膜幹細胞の機能を低下させているという仮説の下に、マクロファージを消失させたマウスの角膜にナイロン糸を縫合して炎症を惹起し、角膜幹細胞の機能解析を行う。同時に炎症下においてマクロファージは、様々な炎症性サイトカインを放出している。その代表としてIL-1bやTNF-aが知られており、これらのサイトカインに対するブロッキング抗体を用いた上で角膜にナイロン糸を縫合し炎症を惹起後、角膜三叉神経への影響と角膜幹細胞の評価を行い、相関性があるかを評価していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2014年度に、炎症惹起時またその後の状況における幹細胞の蛋白定性・定量分析を行い、その結果を踏まえて炎症が角膜三叉神経と角膜stem/progenitor細胞の両方に影響することを国内外学会において発表する予定であったが、定性分析の結果、特に免疫染色において角膜炎症モデルのより鮮明な結果を提出できず、再度至適条件を模索している。またフローサイトメトリーによる角膜縫合糸設置後、抜糸後の安定した定量条件の見直しを行っているため、計画を変更し他の角膜幹細胞マーカーの解析を行う等代替案も含め再検討している。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は、フローサイトメトリーを用いて、マウス角膜に縫合糸設置後、抜糸後の安定した角膜幹細胞定量条件の見直しを行っているため、計画を変更し他の角膜幹細胞マーカーの解析も行う等再検討している。また免疫染色においても同様に他の角膜幹細胞マーカーにおいて代替できるかを模索していく。 引き続いて、活性化したマクロファージの存在が角膜幹細胞の機能を低下させているという仮説の下に、マクロファージを消失させたマウスの角膜にナイロン糸を縫合して炎症を惹起し、角膜幹細胞の機能解析を行う。同時に炎症下においてマクロファージは、様々な炎症性サイトカインを放出している。その代表としてIL-1bやTNF-aが知られており、これらのサイトカインに対するブロッキング抗体を用いた上で角膜にナイロン糸を縫合し炎症を惹起し、角膜幹細胞量の計測も更に行う計画である。
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