| 研究課題/領域番号 |
25861665
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
中田 光政 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (90375775)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 直腸肛門奇形 / Wnt5aコンディショナルノックアウト / 肛門括約筋群 |
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| 研究概要 |
直腸肛門奇形では手術により、肛門を形成して排便ルートを確保するが、肛門括約筋の発達が未熟で術後の排便機能が改善しない症例も多くある。直腸肛門奇形は、遺伝性はないものの約半数に合併奇形が存在し、発生過程における遺伝子発現レベルの低下が疾患発症、および肛門括約筋群の未熟性の要因となっていることが考えられる。基礎医学的には原因遺伝子は同定されていなく、肛門の開口・肛門括約筋群の発達に関与する遺伝子も未だ十分解明されていない。直腸肛門奇形モデルマウスを使用し、肛門の開口・肛門括約筋群の発達に関与する遺伝子を同定することで肛門括約筋発達の分化促進の可能性を検討する。研究計画はモデルマウスによる発生学的解剖の観察と遺伝子発現解析、および分化誘導実験である。これまでSdマウス、レチノイン酸投与マウスの2種類のモデルマウスを使用し、直腸肛門奇形の発生学的にcloacal plateの伸長が不全になり、遺伝子発現解析ではWnt5aが関与することを同定した。新たにWnt5aコンディショナルノックアウトマウスを使用した。Wnt5a-loxpマウスとCRE-ERTマウスにおいてWnt5a loxp/loxp,CRE+/-雄×Wnt5a loxp/loxp雌の交配で得られる胎仔に対してタモキシフェンを腹腔内投与し、CREを発動させてWnt5aをノックアウトさせ、表現形を得る。まず、直腸肛門領域における至適投与量至適時期を検討する必要がある。タモキシフェンの投与時期別に予想される表現形はE9（高位鎖肛）、12（低位鎖肛）、14（鎖肛にならない）でそれぞれにおいてタモキシフェンの至適投与量を検討する。野生型での検討では母胎体重0.05mg/kg、0.1mg/kgで比較すると0.1mg/kgではほぼ胎仔は致死で、0.05mg/kgでは胎仔発育は正常に進むことが判明した。初年度はマウスの繁殖中心であったため、今後モデルマウスにてタモキシフェンの至適投与量を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度はマウスを一組のつがいから繁殖し、Wnt5a loxp/loxp,CRE+/-雄×Wnt5a loxp/loxp雌の交配ができるところまで数を増やした。数の少ないところからの繁殖であったため、充分な数まで増殖するのに時間を要した。併行して野生型でタモキシフェンの毒性についての検討を施行したので今後、モデルマウスでの検討に入る。
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| 今後の研究の推進方策 |
Wnt5a コンディショナルノックアウトマウスで投与するタモキシフェンを0.05，0.075，0.1mg/kg（母体）と振り分け、表現形と致死性を比較し、至適投与量を検討する。至適投与量をE9、E12、E14で母胎腹腔内投与し、直腸肛門の表現形をHE染色で観察する。筋分化マーカーであるMyogeninn、MyoDにて免疫染色し、中胚葉組織の筋分化細胞の細胞数や筋発達を観察する。Wnt5a コンディショナルノックアウトマウスの直腸肛門の mRNA を回収し，マイクロアレイにて遺伝子発現解析を行い、Wnt5a発現低下により低下する遺伝子を振り分ける予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
初年度であり、使用モデルマウスの繁殖が充分量到達しなかったため、実験準備に必要なもの以外の実験試薬の購入を見合わせた。実験準備に必要な試薬類はプライマー・DNA抽出キット、タモキシフェン、マウス試料、マウスケージ・ラックであった。
当該年度は繁殖用と実験用のマウスが十分ある形で実験を推進させるため、マウスラック・ケージの拡充を行った。また、次年度にはマウス維持にかかる経費及び実験の進捗に合わせて試薬購入をおこなう。Wnt5a loxp/loxp,CRE+/-雄×Wnt5a loxp/loxp雌の交配で得られるコンディショナルノックアウトの胎仔をHE染色で観察する諸経費、発現遺伝子解析の免疫染色のための抗体の購入やマイクロアレイの業務委託を計画している。
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