| 研究課題/領域番号 |
25861894
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
油井 知雄 北海道医療大学, 歯学部, 助手 (80548438)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | Micro-Gap / RAW264.7 / RANKL / M-CSF |
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| 研究概要 |
１.新たな培養基質の作製
破骨細胞の培養に用いる基質を新たに２種作製し、検討することにした。基質の作製は、Dr.Brunette らの方法に従い、従来型のブラストエッチング処理(SLA)に対して、サイズの異なる Micro-Gap を有する Box 型 のチタンレプリカを作製し、それぞれ電 子顕微鏡で観察した。これらの基質のほうが研究計画で記した基質と比較してもMicro-Gap を有する Box 型 を連続させて配列させているため、破骨細胞の動態に有意な差を認めると考えた。なお、コントロールには滑沢（smooth）なチタンレプリカを用いた。
2．細胞培養と培養条件の検討
細胞培養はマウスマクロファージ様破骨前駆細胞（RAW264.7）を10％FBS、D-MEMを用いて100mmのスタンダードディッシュ中に播種した。その後、増殖した細胞を回収し、10％FBS、α-MEMを用いて６ウェルマルチプレートに１穴あたり１×１０４個の細胞密度で播種し、50ng/mlリコンビナントマウス RANKL蛋白(rmRANKL)、M-CSF50ng/mlの存在下において５日間 培養し、破骨前駆細胞に分化、促進させた。現在は破骨細胞に成熟したことを確認するためにコントロール基質におけるTRAP染色を実施し、成熟の程度を観察している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
破骨細胞に分化、促進に適切なRANKL、M-CSFの濃度と培養条件の検討は概ね良好であるが、さらに安定した培養条件の獲得のためにまだ検討する余地があるため、今年度内の研究予定より遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ニコチン刺激下における破骨細胞の培養条件の確立を得ることでほぼ実験は軌道に乗ると考えられる。よってこの部分のおける実験遂行を最優先に進める。また培養条件が安定しないようであればRANKL、M-CSF試薬がキット化されている破骨前駆細胞の使用も検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
次年度は研究に用いる試薬がQ－PCR、それに伴うPCRプライマーの作製、またSEMなどの高価な試薬を消耗する予定のため、次年度使用額が生じると考えられる。
研究の消耗試薬のなかでも高価なQ－PCRの試薬、共焦点レーザー顕微鏡の際に用いる１次、２次抗体の購入を優先的に検討する。
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