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H25は破骨細胞の培養に用いた基質はコントロールには滑沢なsmooth基質とし、他に各種のGroove基質を用いた。①不規則で粗い溝が一定方向に付与された深さ0.2-0.4μmのmicro-achieved(micro) ② 1μmの溝、2μmのridge、深さ1.5μm（narrow）③ 2μmの溝、4μmのridge、深さ1.5μm（wide）の3種類とした。これらに細胞動態に有意な差を与えるために２種類の基質をブリティッシュコロンビア大学の Dr.Brunette らの方法に従い、④ブラストエッチング処理(SLA)⑤Micro-Gap を有するBox型（micro-box）を対象とし、研究計画に追加した。細胞の培養条件は破骨前駆細胞(RAW264.7)を10%FBS、1%ペニシリンとストレプトマイシン添加のD-MEM培地で100mmのディッシュに4×105個を播種した。細胞増殖後に1×104個を6ウェルプレートに播種し、50ng/mlのrmRANKL、50ng/mlのM-CSFの存在下で７日間培養し、破骨細胞に分化、促進させた。なおニコチン濃度は培養上清に（0、10-5、10-4、10-3M）で添加、刺激した。破骨細胞分化の確認はTRAP染色し、光学顕微鏡で観察した。各種ニコチン濃度において①～③の基質において紫色の多核を有するTRAP陽性反応の巨細胞を確認した。H26は細胞の表面形態、微細構造を観察するために培養から5日、7日後に走査形電子顕微鏡(SEM)にて各基質上の細胞を観察、撮影した。各種ニコチン濃度における①～③のGroove基質上では細胞の配列はgrooveと平行方向に楕円形を呈したものが多く，ニコチンの濃度による影響は見受けられなかった。なお細胞周辺部のfilopodiaはsmooth基質上の細胞に比べて多い傾向にあった。さらにSmooth基質と①～③のgroove基質上の細胞でのfocal contactの形成への影響を検索するためにproline-rich tyrosine kinase 2（Pyk2）の mRNAの発現を定量的RT-PCR法を培養７日目に行ったが、これもニコチンの濃度による影響は見受けられなかった。④と⑤の基質の検討は今後の検討課題とした。
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