| 研究課題/領域番号 |
25862032
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 東京歯科大学 |
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研究代表者 |
本間 宏実 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (80637760)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 歯根膜 / 細胞外マトリックス |
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| 研究概要 |
本研究では，歯根膜細胞への分化能を有する初代培養歯原性間葉系細胞 (DMC)を実験に供し，歯胚形成において帽状期，鐘状期の限られた期間に発現が認められる歯小嚢特異的発現遺伝子F-spondinのTGF-βシグナルに対する作用の検討を行った．
はじめに，TGF-βによる歯根膜細胞分化誘導に対するF-spondinの効果を検討した．DMC，マウス由来歯根膜細胞株MPDL22，およびC3H10Tl/2細胞をTGF-β1で刺激して培養した後，歯根膜関連遺伝子であるペリオスチン，テネイシン NおよびI型コラーゲンの発現を，特異的プライマーを用いて定量的PCR法により検討した結果，ペリオスチンならびにテネンシン Nの発現が有意に増加した．さらに，DMC，MPDL22，およびC3H10Tl/2細胞に対して，アデノウイルスを用いてF-spondinの遺伝子導入を行い，TGF-β刺激で刺激して培養した後，前述と同様にして，歯根膜関連遺伝子の発現を特異的プライマーを用いて定量的PCR法により検討した結果，TGF-β依存性のペリオスチン，テネンシン NおよびI型コラーゲンの発現を抑制した．これらの結果はF-spondinはTGF-βシグナルを阻害することにより，歯根膜細胞分化を抑制している可能性を示唆している．
次に，F-spondinの効果がTGF-βシグナルに関与しているものか否かを検討する目的で，TGF-βシグナルの伝達分子であるSmad3のリン酸化に対するF-spondinの効果を，蛍光細胞免疫染色により調べたところ，DMCにおけるTGF-β刺激はSmad2/3のリン酸化を著明に誘導すること，またその発現部位は核内に認められることが確認された．現在，F-spondinが過剰発現されたDMCにおけるSmad2/3のリン酸化をウェスタンブロッティング法により検討中である．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
歯根膜細胞への分化能を有する初代培養歯原性間葉系細胞 (DMC)を用いて，TGF-βによる歯根膜細胞分化誘導に対するF-spondinの効果を検討したところ，F-spondinはTGF-β誘導性の歯根膜細胞分化に対して抑制的に作用することが明らかとなった．
現在，TGF-βシグナルに対する転写レベルでの作用の検討を進めており，当初策定した研究計画書どおりおおむね順調に進展している．
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| 今後の研究の推進方策 |
現在，TGF-β誘導性Smadシグナル活性化に対するF-spondinの効果を，ウェスタンブロッティング法により検討を行っている．今後，TGF-βシグナルに対するF-spondinの転写レベルでの効果を，Smad結合配列 (CAGA) を用いたレポーターアッセイにおいて検討したいと考えている．また，F-spondinの発現に影響を及ぼす因子を明らかにするために，DMCを用いて歯胚形成に関与するWnt3a，IhhおよびTGF-β1刺激を行い，F-spondinの発現の変化をリアルタイムPCR法により検討する予定である．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度に，TGF-β誘導性Smadシグナル活性化に対するF-spondinの効果を，ウェスタンブロッティング法により検討する予定であったが，所属機関の実験施設移転のため，その解析を次年度に行うこととし，未使用額はその経費に充てることとしたい．
現在，ウェスタンブロッティング法により解析実施中である．
今後，TGF-βシグナルに対するF-spondinの転写レベルでの効果を，Smad結合配列 (CAGA) を用いたレポーターアッセイにおいて検討したいと考えている．また，F-spondinの発現に影響を及ぼす因子を明らかにするために，DMCを用いて歯胚形成に関与するWnt3a，IhhおよびTGF-β1刺激を行い，F-spondinの発現の変化をリアルタイムPCR法により検討する予定である．
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