| 研究課題/領域番号 |
25862034
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
伊藤 龍朗 日本大学, 歯学部, 助教 (60635126)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | バイオフィルム / SspBペプチド |
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| 研究概要 |
う蝕をはじめとする口腔内感染症は、口腔細菌により形成されたバイオフィルム（B.F.）に起因しており、ペリクルへの付着から始まる。また、口腔内 B.F.は薬剤耐性遺伝子のリザーバーであり、従来の殺菌的・静菌的な制御法とは異なる新規 B.F.制御法の確立が望まれている。そこで申請者は、初期付着の阻害という着想に至った。
本研究はin vitro、in vivoの両面から評価を行う予定である。平成25年度ではin vitro: SspB ペプチドの機能解析を行い、成果をまとめた。ELISA法、B.F.アッセイを用いて、SspBペプチドのヒト唾液への結合能や、B.F.抑制効果を評価した。
(1) ヒト唾液（濾過滅菌済み）をコートしたELISAプレートに、複数種のビオチン化SspB相同ペプチド（650 μM）を処理した。アルカリフォスファターゼによる発色反応をプレートリーダー (405 nm) にて解析する事で、ヒト唾液との反応性が最も高いペプチドを選別した。
(2) ヒト唾液をコートした細胞接着プレートに、選別したSspB相同ペプチドを加えた。プレート1 well あたり、20 μl (4.0×104CFU) のS. mutans菌液：180 μlのTSB (without dextrose) 培地を加え、37℃で培養した。形成されたB.F.を染色し、プレートリーダー (492 nm) にて評価した。
(3) ペプチドに殺菌作用がない事を検証するため、SspB相同ペプチド、0.04%クロルヘキシジン、未処理、それぞれの条件での細菌のgrowthを濁度計にて計測した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度ではELISA法、B.F.アッセイを用いて、SspBペプチドのヒト唾液への結合能や、S. mutansのB.F.抑制効果を評価した。
更に、SspBペプチドによる、歯周病原性細菌P. gingivalisへの特異的相互作用をELISA法により検証し、その成果を第28回日本小児歯科学会・関東地方会にて発表した。
以上より、達成度はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
ペプチドと唾液の結合能については、ELISA法に加えてBIAcore システムにより、分子レベルでの解析を実施する。B.F.アッセイでは、細胞接着プレートによる手法から、ハイドロキシアパタイトディスクを用いて、よりヒトの歯面に近似したコンディションで検討を行う。
更に、in vivo: SspB 相同ペプチドのマウス口腔内への応用を行う。申請者らが確立したNOD/SCID.e2f1-/-マウスによる実験系は、ヒトの唾液ペリクルを再現している。SspB 相同ペプチドによる B.F.抑制効果を口腔内という実環境の中で評価する。
<SspB相同ペプチドのマウス口腔内への応用＞
NOD/SCID.e2f1-/-マウスのメス（4か月齢）を使用する。クロルヘキシジンにてマウス口腔内を消毒し、PBSにて洗浄後ヒト唾液をマウス歯面に処理する。次にB.F.抑制効果のみられたペプチドを歯面に処理し、S. mutans MT8148株のovernight culture (109 CFU/ ml) 250 μlを接種する。菌接種から180分間、30分毎に滅菌綿球によるスワブ法で菌を回収する。回収した菌をPBSに懸濁し、MSB培地に植菌、得られたコロニー数を、ペプチド処理群と未処理群とで比較する。また、DNAベースによる評価では、回収菌をテンプレートとしたPCRを行う。画像解析システム（ATTO社製デンシトグラフ）を使用して、S. mutans-specific primer を用いたPCR産物の濃度を蛍光強度から定量し、ペプチド処理群と未処理群とで比較する。
蛍光強度によるPCR産物の定量性が困難な場合には、SYBRグリーン法や蛍光プローブ法による定量PCRで対応する。
２カ年で得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度では、国内（岐阜）での学会発表を予定していたが、成果発表が間に合わず神奈川県にて成果発表を行った。岐阜への旅費代が浮いたため、次年度使用額として生じた。
SspBペプチドの追加合成が必要になるため、ペプチド合成代に充てる。更に、B.F.アッセイの追加消耗品として、ハイドロキシアパタイトディスクの購入に充てる。
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