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2013 年度 実施状況報告書

細胞内生体分子を標的とする大環状Nアルキルペプチドの高速試験管内分子進化

研究課題

研究課題/領域番号 25870146
研究種目

若手研究(B)

研究機関東京大学

研究代表者

川上 隆史  東京大学, 総合文化研究科, 特任研究員 (60638881)

研究期間 (年度) 2013-04-01 – 2015-03-31
キーワードペプチド / Nアルキルアミノ酸 / リボソーム / ケミカルバイオロジー / タンパク質 / tRNA / リガンド / PUREシステム
研究概要

本研究の目的は、人工改変した再構成型無細胞翻訳系(PUREシステム)を用いて大環状Nアルキルペプチドの大規模ライブラリーをリボソーム翻訳合成し、高速試験管内分子進化法を用いてそのライブラリーの中から標的タンパク質に結合する大環状Nアルキルペプチドをセレクションすることである。まず、tRNAに連結させた様々な環状Nアルキルアミノ酸(22種類)と再構成型無細胞翻訳系を用いて、それらの翻訳ペプチドへの導入について同定と効率の評価を行い、リボソーム翻訳基質として有効な環状Nアルキルアミノ酸を見い出すことに成功した。また、新規翻訳伸長因子elongation factor P(EF-P)を再構成型無細胞翻訳系に添加することによりNアルキルペプチドライブラリーの翻訳合成量を増加することができることを見いだした。また、翻訳後に生体直交性化学反応や酵素反応を用いることによって、直接的にはリボソーム翻訳ペプチドに導入することができない様々な荷電Nアルキルアミノ酸を、効率的に翻訳ペプチド内に構築することに成功した。
更に、40種類以上の大腸菌由来のtRNAを調製してNアルキルアミノ酸を連結し、再構成型無細胞翻訳系に加えてモデルペプチドの翻訳合成を行なった。その結果、大腸菌由来のtRNAGluあるいはtRNAAspを用いることにより、様々なNアルキルアミノ酸(Nメチルバリン、Nメチルロイシン、Nメチルイソロイシン、Nメチルトリプトファン、Nメチルシクロヘキシルアラニン、Nメチルフェニルグリシンなど)の翻訳ペプチドへの導入効率を向上させることができること、Nアルキルアミノ酸の重合効率(連続導入効率)を向上させることができること、NアルキルペプチドのmRNA提示効率を向上させることができることも見いだした(論文投稿中(研究代表者責任著者))。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

リボソーム翻訳ペプチドに効率的に導入可能な環状Nアルキルアミノ酸を発見し、新規翻訳伸長因子elongation factor P(EF-P)が非天然Nアルキルアミノ酸の連続導入効率を向上させることを発見し、翻訳後変換反応を用いて荷電Nアルキルアミノ酸を効率的に翻訳ペプチド内に構築することに成功し、その他様々なNアルキルアミノ酸を効率的に翻訳ペプチドに導入可能なtRNAGluおよびtRNAAspを発見したためである。

今後の研究の推進方策

様々な構造を持つクロロアセチルNアルキルアミノ酸、クロロ酢酸、クロロメチル安息香酸を翻訳開始tRNAに連結して再構成型無細胞翻訳系(PUREシステム)に加えることにより、翻訳開始効率の良いNアルキルアミノ酸および(アミノ基を持たない)カルボン酸の同定を目指す。そして、その翻訳開始効率の良いNアルキルアミノ酸および(アミノ基を持たない)カルボン酸、新規翻訳伸長因子elongation factor P(EF-P)、大腸菌由来のtRNAGluなどを用いて、大環状Nアルキルペプチドの大規模ライブラリーを実際にリボソーム翻訳合成し、高速試験管内分子進化法を用いてそのライブラリーの中から標的タンパク質に結合する大環状Nアルキルペプチドをセレクションする。

次年度の研究費の使用計画

研究計画が非常に順調に進んだため、計画よりも研究費を抑えることが可能となった。また、所属施設に共用機器が導入されたため、計画よりも研究費を抑えることが可能となった。
引き続き、有機合成試薬、オリゴDNA、分子生物学・生化学試薬、細胞培養試薬などの物品費、学会発表のための旅費として使用する計画である。

  • 研究成果

    (14件)

すべて 2014 2013

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (8件) 図書 (1件) 産業財産権 (2件)

  • [雑誌論文] Incorporation of electrically charged N-alkyl amino acids into ribosomally synthesized peptides via post-translational conversion2014

    • 著者名/発表者名
      Takashi Kawakami, Toru Sasaki, Reid C. Patrick, Hiroshi Murakami
    • 雑誌名

      Chemical Science

      巻: 5 ページ: 887-893

    • DOI

      10.1039/c3sc52744a

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Patch cloning method for multiple site-directed and saturation mutagenesis2013

    • 著者名/発表者名
      Naohiro Taniguchi, Sayumi Nakayama, Takashi Kawakami, Hiroshi Murakami
    • 雑誌名

      BMC Biotechnology

      巻: 13 ページ: -

    • DOI

      10.1186/1472-6750-13-91

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics2013

    • 著者名/発表者名
      Takashi Kawakami, Takahiro Ishizawa, Hiroshi Murakami
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 135 ページ: 12297-12304

    • DOI

      10.1021/ja405044k

    • 査読あり
  • [学会発表] 高速試験管内進化法の開発と新規機能性ポリペプチドの探索への応用2013

    • 著者名/発表者名
      石沢尭大、川上隆史、村上裕
    • 学会等名
      第36回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      神戸ポートアイランド(兵庫県神戸市)
    • 年月日
      20131205-20131205
  • [学会発表] Ribosomal incorporation of diverse cyclic N-alkyl amino acids2013

    • 著者名/発表者名
      Takashi Kawakami, Takahiro Ishizawa, Hiroshi Murakami
    • 学会等名
      The 4th Asia-Pacific International Peptide Symposium
    • 発表場所
      ホテル阪急エキスポパーク(大阪府吹田市)
    • 年月日
      20131107-20131107
  • [学会発表] Ribosomal synthesis of charged N-alkyl amino acid-containing peptides2013

    • 著者名/発表者名
      Takashi Kawakami, Toru Sasaki, Patrick C. Reid, Hiroshi Murakami
    • 学会等名
      The 4th Asia-Pacific International Peptide Symposium
    • 発表場所
      ホテル阪急エキスポパーク(大阪府吹田市)
    • 年月日
      20131107-20131107
  • [学会発表] High-Speed In Vitro Selection and Evolution of Functional Polypeptides Using TRAP Display2013

    • 著者名/発表者名
      Takahiro Ishizawa, Takashi Kawakami and Hiroshi Murakami
    • 学会等名
      The 4th Asia-Pacific International Peptide Symposium
    • 発表場所
      ホテル阪急エキスポパーク(大阪府吹田市)
    • 年月日
      20131107-20131107
  • [学会発表] 高速試験管内分子進化法を用いた血管内皮増殖因子受容体阻害ペプチドの開発2013

    • 著者名/発表者名
      川上隆史、石沢尭大、藤野公茂、菅裕明、村上裕
    • 学会等名
      第7回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      名古屋大学豊田講堂(愛知県名古屋市)
    • 年月日
      20130927-20130927
  • [学会発表] 高速試験管内進化分子工学法を用いた大規模ペプチドライブラリーの構築2013

    • 著者名/発表者名
      石沢尭大、川上隆史、村上裕
    • 学会等名
      第7回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      名古屋大学豊田講堂(愛知県名古屋市)
    • 年月日
      20130927-20130927
  • [学会発表] 内皮細胞の血管新生を阻害する非天然型環状ペプチドの高速分子進化法による創製2013

    • 著者名/発表者名
      川上隆史、石沢尭大、藤野公茂、Patrick C. Reid、菅裕明、村上裕
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第8回年会
    • 発表場所
      東京医科歯科大学M&Dタワー(東京都文京区)
    • 年月日
      20130621-20130621
  • [学会発表] 新規機能性ポリペプチドの探索を指向した高速試験管内進化分子工学法の開発2013

    • 著者名/発表者名
      石沢尭大、川上隆史、村上裕
    • 学会等名
      日本ケミカルバイオロジー学会第8回年会
    • 発表場所
      東京医科歯科大学M&Dタワー(東京都文京区)
    • 年月日
      20130620-20130620
  • [図書] 進化分子工学 ~高速分子進化によるタンパク質・核酸の開発~2013

    • 著者名/発表者名
      石沢尭大、川上隆史、村上裕
    • 総ページ数
      12 (389-400)
    • 出版者
      NTS
  • [産業財産権] 荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法2013

    • 発明者名
      村上裕、川上隆史、佐々木亨、パトリック・ライド
    • 権利者名
      村上裕、川上隆史、佐々木亨、パトリック・ライド
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願2013-162440
    • 出願年月日
      2013-08-05
  • [産業財産権] ペプチドライブラリの製造方法、ペプチドライブラリ、及びスクリーニング方法2013

    • 発明者名
      村上裕、川上隆史、佐々木亨、パトリック・ライド
    • 権利者名
      村上裕、川上隆史、佐々木亨、パトリック・ライド
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願2013-100661
    • 出願年月日
      2013-05-10

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公開日: 2015-05-28  

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