低分子化合物を用いて骨・歯周組織を再生する方法を開発するために、骨芽細胞分化促進化合物のハルミンの作用標的分子を明らかとすることを目的として、前年度に引き続き、以下の検討を行った。 (1)前年度までの研究によって、ハルミンの骨芽細胞分化促進作用には、BMPシグナル経路の他、Wntシグナル経路やヘッジホッグシグナル経路なども関与していることが示唆されたことから、ハルミン添加による各シグナル経路の活性化に対する影響をルシフェラーゼアッセイにて検討した。その結果、BMP経路とともに、Wntシグナル経路やヘッジホッグシグナル経路の活性化も認められた。(2)前年度に準備したmRNAサンプルを用いて、マイクロアレイ解析を行い、ハルミンによって発現が変動する数百の遺伝子を同定した。また、パスウェイ解析によって、発現変動の多い経路を複数見出だした。(3)ハルミンによって発現が変動するタンパク質の網羅的解析のため、ハルミン刺激後の培養上清中のセクレトーム解析を行い、複数のタンパク質の同定に成功した。(4)ハルミン誘導体を結合させた磁性ナノアフィニティービーズを用いて、ハルミンに直接結合するタンパク質の精製・同定を試み、複数の候補タンパク質のバンドを検出した。 本研究によって、ハルミンの骨芽細胞分化促進作用には、BMP経路、Wntシグナル経路、ヘッジホッグシグナル経路の活性化が関わっている可能性が明らかとなり、それらのシグナルの活性化に関連する発現変動遺伝子やタンパク質の情報を得ることができた。今後は、ハルミンに直接結合する分子の同定を含めて、さらに詳細な作用機構の検討を行う予定である。
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