| 研究課題/領域番号 |
25870386
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| 研究機関 | 獨協医科大学 |
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研究代表者 |
大塚 裕一 獨協医科大学, 医学部, 助教 (10548861)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | トキシン / アンチトキシン / 非コードRNA / 翻訳 / mRNA分解 / 大腸菌 |
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| 研究実績の概要 |
細菌が持つトキシン-アンチトキシン系（TAS）は、ストレス時に発現するトキシンが自身の増殖を停止させる仕組みである。本研究課題はトキシンが持つ毒性の分子機構とその活性制御機構を明らかにし、TASの生物学的役割をより明確にすることが目的である。本年度は大腸菌O157株が持つTAS, z3289-sRNA1を研究対象として、sRNA1アンチトキシンによるz3289トキシンの翻訳抑制機構の解明を集中的に実施した。sRNA1は非コードRNAであり、z3289 mRNAの翻訳開始領域の上流と20塩基の相補鎖を形成してz3289の翻訳を抑制するが、その分子機構は不明であった。今回、in vivoとin vitroでのz3289の発現検出系の構築と各RNAの安定性を解析することで、その分子機構の大部分を明らかにした。sRNA1がない場合、z3289は発現して毒性を発揮するが、sRNA1がある場合、sRNA1がz3289 mRNAと相補鎖を形成することで、翻訳開始領域でステムループが形成され、リボソームが結合できず、z3289の翻訳が抑制されることが明らかになった。また、ステムループを形成したz3289 mRNAは、RNase Eにより積極的に分解されることも分かった。これは、リボソームがmRNA上にリクルートされないためにRNase Eによる切断を受けやすくなったためであると考えられる。以上の結果は、翻訳開始に必要でない領域での非コードRNAの結合が、翻訳開始領域の2次構造を変化させて、翻訳抑制とmRNA分解の両面で遺伝子発現を抑制する数少ない事例である。現在、ステムループの形成と解離の分子機構について調べている。またこのTASの生物学的役割として、高温などの環境ストレスに対する応答に関わる可能性が示唆された。今後、この可能性の検討と薬剤に対するパーシステンス現象との関係を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究課題は４つの研究項目からなるが、その中の１つ、「sRNA1アンチトキシンによるz3289トキシンの翻訳抑制機構の解明」に関しては、制御の分子機構がほぼ明らかになり、現在論文作成を行っている。よって、この研究項目は当初の計画より進展している。研究項目の１つ「パーシステンスにおけるz3289トキシンの役割の解析」に関しては、研究計画を遂行する中で、z3289トキシンの新たな役割が明らかになってきた。来年度はその役割とパーシステンス現象との関係について検討する予定である。よって、この研究項目もおおむね順調に進展していると考える。また、残り２つの研究項目「z3289トキシンの発現から増殖停止の原因である活性酸素の発生までの機構の解明」と「トキシンペプチドによる抗菌効果の検討」に関しては、予定していたほど実験は進んでなく、現在のところ期待していた成果はまだ得られていない。従って、全体として本研究課題はやや遅れていると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 「sRNA1アンチトキシンによるz3289トキシンの発現制御」に関しては、その分子機構がほぼ明らかになったので、現時点までの結果を論文する予定である。本研究項目において、トキシンの発現のためにステムループ構造の解離が起こるが、それに作用する因子とその機構が未だ不明である。従って、来年度は論文作成と同時にこの課題に取り組む予定である。
(2) 「パーシステンスにおけるz3289トキシンの役割の解析」に関しては、高温ストレスに対する細胞応答にz3289が関わる結果が得られたので、その分子機構を明らかにする。また、高温以外の環境ストレス応答への関与についても検討する。加えて、ストレス応答に対するz3289の役割と薬剤に対するパーシステンス現象との関係についても解析する。
(3) 「z3289トキシンによる毒性の分子機構」に関しては、z3289による活性酸素の発生機構の解明を優先課題として、集中的に実験を行う。具体的には、z3289は活性酸素の発生に必要な2価鉄イオンと過酸化水素の細胞内濃度を何らかの機構で上昇させていると考えられる。そこで、細胞内への鉄の取り込みや過酸化水素の発生にかかわる因子の変異株を用いて、その分子機構を明らかにする。
(4) 「トキシンペプチドによる抗菌効果の検討」については、細胞内で発現させた場合に毒性を示す最小ペプチドを決定したので、そのペプチドを化学合成して、O157株を含めた様々な細菌に対する抗菌効果を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度計画していた次世代シークエンサーを用いた実験計画が、試料調整等に難航して実施できなかった。また、研究代表者が４月に所属先を移動したため、研究活動が予定していたほど進まなかった。加えて、計画していた海外学会への参加が時間的な余裕がなくできなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
主として研究の遂行に必要な試薬やキット、消耗品、合成DNAプライマーや合成RNA、合成ペプチド、シークエンス解析などに使用する。また次年度は、国内外での学会や研究会への参加費用と旅費、論文発表のための費用として使用する。
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