| 研究課題/領域番号 |
25870400
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
山元 淳平 大阪大学, 基礎工学研究科, 助教 (90571084)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | DNA損傷 / DNA修復 / 光反応 / 酵素 |
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| 研究概要 |
環境光は様々な生体反応を引き起こすが、紫外線によって生じたDNA損傷を青色光依存的に修復することができる(6-4)光回復酵素の詳細な分子メカニズムは、依然明らかとなっていない。申請者は近年、世界に先駆けて本反応の完了に2光子必要であることを明らかにした。この発見に基づいて、2光子DNA修復反応機構の詳細な分子メカニズムおよび本酵素における損傷DNAの基質一般性・基質認識機構について明らかにし、青色光応答型生体防御メカニズムの全容を解明することを本研究課題の目的とした。
まず、研究対象であるアフリカツメカエル(6-4)光回復酵素の三次元モデル構造を、すでに結晶構造が報告されているショウジョウバエの(6-4)光回復酵素から構築した。これを参考に、(6-4)光回復酵素の修復反応に関与することが予想されるアミノ酸側鎖変異体プラスミドを5種類作成し、形質転換した大腸菌の紫外線感受性を調べた。すると、基質認識に関与すると考えられる変異体2種類のうち、１つにおいて有意な生存率の低下が見られたことから、このアミノ酸が認識段階において重要な役割を果たすことが分かった。また、修復反応に直接寄与することが考えられるアミノ酸変異体3種類は、全て生存率が大幅に減少したことから、修復反応において重要な役割を果たすことが明らかとなった。
現在、これらのアミノ酸側鎖変異体の単離精製を行っており、2種類の変異体精製に成功している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度に実施計画していた研究のうち、定量的な酵素反応解析は未実施であるため、平成25年度予定の研究は半分程度しか進展していない。これは、サンプル調製において当初の予想よりも厳密な嫌気条件が必要であるということが明らかになったためである。現在、新たな共同研究先にてグローブボックスを借りてサンプル調製を行うことで、この問題を解決したところであるため、今後研究が進展するものと考えられる。
その問題を解決する間に、当初の予定では平成26年度実施予定の計画について一部先に実施した。この結果、平成26年度分の研究予定のうち半分程度は進展が見られたため、当初の予定とは異なるものの、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
酵素基質認識に関与する変異体について、大腸菌生存実験・精製タンパク質による定性的修復効率を実施したところ、有意な違いが明らかとなったため、今後は精製タンパク質および蛍光ラベルしたDNAを用い、結合能の評価および結合モードの評価を蛍光異方性滴定実験から明らかにする。
修復反応に関与する変異体については、3種類のアミノ酸側鎖変異体を精製タンパク質として得、これらを用いて定量的な反応量子収率算出ならびに２光子DNA修復反応における中間体の寿命測定を行うことで、修復反応のどの段階にこれらアミノ酸側鎖が寄与しているか、詳細に調べる予定である。
また、修復反応の基質一般性について、これまでに研究が進展しているチミン-チミン間に形成されるDNA損傷の他に、チミン-シトシン間に形成されるDNA損傷を化学的に合成し、オリゴヌクレオチドに導入することに成功したため、上記反応効率の定量算出を行う予定である。
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