2013 年度実施状況報告書

アトピー性皮膚炎のバリア機能破綻に関わるタンパク質群の網羅的な同定・相対定量解析

研究課題

研究課題/領域番号	25870453
研究種目	若手研究(B)
研究機関	島根大学
研究代表者	高橋仁島根大学, 医学部, 助教 (10432618)
研究期間 (年度)	2013-04-01 – 2016-03-31
キーワード	Proteomics / アトピー性皮膚炎
研究概要	アトピー性皮膚炎の角層バリア機能の破綻は、様々な細胞接着因子やプロテアーゼおよびサイトカインなどが関与するが、これまで、これらのタンパク質群の変動を一度に捉える方法は無かった。iTRAQ法は、質量分析計を用いて、検体間で増減しているタンパク質群を網羅的に相対定量する有用な方法である。本研究は、アトピー性皮膚炎の角層バリアの破綻に関わるタンパク質群を明らかにすることを目的とし、iTRAQ法を用いて、アトピー性皮膚炎の局所病変部の角層中に特異的であり、かつ、病勢に関与するタンパク質群を網羅的に定量・同定することを計画している。初年度は、テープストリッピング法を用いて採取した角層タンパク質に対してiTRAQ法に適した抽出条件を検討した。対象はアトピー性皮膚炎患者2名とし、対照は2名の健常人とした。それぞれの角層採取部位は頸部に統一した。セロテープと角層を有機溶媒で剥離させ、角層を採取した。角層タンパク質は尿素を用いて抽出し、トリプシン消化した。その後、トリプシン消化物をiTRAQ試薬でラベルした。iTRAQ法のデザインは、各アトピー性皮膚炎患者の頸部角層タンパク質と2名の健常人の頸部角層タンパク質のPoolを一組とし、2組のサンプルをnano-LC-MALDI/TOFを用いて相対定量解析した。その結果、最大218個のタンパク質が同定され、ケラチン以外のタンパク質は191個であった。現在、これらのタンパク質のうち、発現差を有するタンパク質のデータベース解析を実施している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本年度、アトピー性皮膚炎患者の病変部の角層中の全タンパク質のうち、病変部角層において特異的に増減しているタンパク質群を質量分析法 (iTRAQ法) を用いて網羅的に同定し、候補因子を検索することを主要な目標とした。本年度の成果として、iTRAQ法によって増減しているタンパク質群を検出できたことから、研究の進捗はおおむね順調と判断する。
今後の研究の推進方策	本年度の同定したタンパク質および相対定量できたペプチドの個数は予想よりも少なかった。この原因として、ケラチン以外のタンパク質が有機溶媒によって不溶化し、タンパク質の抽出効率が低下していることが推測される。次年度は、iTRAQ法によるタンパク質の同定率を改善するため、質量分析に適応可能な界面活性剤を用いてセロテープ上の角層タンパク質を直接抽出し、再度相対定量解析を行う予定である。この検討により、より多くの候補因子が同定されることが期待できる。
次年度の研究費の使用計画	当初、iTRAQ法で同定した候補因子の検証を入手可能な抗体を用いて行うことを計画していた。本年度、幾つかの候補因子は同定できたものの、本法で同定したタンパク質および相対定量できたペプチドの個数は予想よりも少なかったため、抗体を用いた同法の検証を行うには至らなかった。抗体を用いたiTRAQ法の検証は、来年度以降、より多くの候補因子を同定した後に実施する必要がある。来年度、角層タンパク質の抽出効率を改善する方法を優先して検討し、より多くの候補因子をiTRAQ法を用いて同定する。抗体を用いたiTRAQ法の検証は、iTRAQ法による候補因子の同定が終了した後に実施する。