|
我々は、DNA複製開始だけでなく、細胞周期を統合的に制御していると考えられるGRWD1の結合候補因子として、マススペクトロメトリーにより転写因子Purαを同定した。このPurαとGRWD1との関連を明らかにすることが本研究の目的である。昨年までのデータから、GRWD1はPurαと協調して、がん抑制因子p53の転写活性化を制御していると考えられたため、更なる解析を進めた。
昨年度はGRWD1-Purα-p53のin vivo interactionを明らかにした。そこで、本年度は各因子の精製組換えタンパク質を作成し、in vitroにおける結合試験を行った。その結果、Purα-p53の直接結合は見られたものの、GRWD1-PurαおよびGRWD1-p53のin vitroにおける直接的相互作用は見られなかった。これらの結果から、GRWD1-Purα-p53結合には何らかの因子が必要だと考えられる。今後、以前行ったGRWD1結合候補因子の探索の結果を元に、GRWD1-Purα-p53複合体の他のサブユニットを同定したい。
また、作成した抗Purα抗体を用いたChIP assayにより、Purαはp53標的因子の一つであるp21プロモーターおよびその周辺領域に結合していることがわかった。In vitroにおける結合試験の結果と併せて考えると、Purαはp53依存的にp21プロモーターおよびその周辺領域にリクルートされている可能性が示唆される。今後は、その可能性について、p53 siRNA処理細胞やブレオマイシン処理によりp53を活性化させた細胞を用いて調べたい。さらに、GRWD1の同領域への結合もChIP assayで調べたい。
|
