巨大分解酵素複合体プロテアソームと活性・分子集合に関わるPI31の複合体構造解析

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25870631
• 研究機関: 兵庫県立大学
• 研究代表者: 高木 賢治 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (90647322)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: プロテアソーム / 分子集合 / X線結晶構造解析 / タンパク質分解酵素

研究実績の概要

プロテアソームは巨大なタンパク質分解酵素複合体であり、複数の相互作用タンパク質群によりその分子集合・活性が調節されている。本研究はプロテアソームの分子集合・活性の両方への関与が報告されているPI31のプロテアソーム調節機構の解明を目的とした。
今年度は、前年度に引き続きプロテアソームとの複合体構造解析に用いるPI31の精製法の検討を行った。ヒトに加えマウス及び酵母のPI31全長および、プロテアソーム結合領域であるPI31 C末端を精製用タグ分子に融合した発現系を作製し、精製方法の検討を行った。またこれらを用い20Sプロテアソームとの複合体形成を試みた。
昨年度作製したα7N末端変異型プロテアソーム（PI31の機能を補完する変異）結晶のX線回折データは、野生型20Sプロテアソームの構造を用いた分子置換法により位相決定を行い、モデル構造の妥当性を示す結晶学的R値がRwork/Rfree = 17.3%/24.2%となるまで構造精密化を繰り返した。最終モデルをもとにPI31による調節機構の検討を行った。活性の上昇が報告されているα3N末端欠損プロテアソームの既知構造ではプロテアソーム内腔へと繋がるゲートは開放された活性型であるが、今回構造決定したα7N末端欠損体ではゲートが閉鎖され、野生型と類似した非活性型構造であった。野生型との構造比較の結果、野生型ではα7N末端が分子表面に突出し、α1N末端はプロテアソーム分子表面に沿うように位置しているのに対し、α7N末端欠損体ではα1N末端が突出しているという違いが見られた。現段階ではPI31のプロテアソーム調節機構の解明には至っていないが、PI31が作用すると考えらえるα7N末端はα1N末端の配向に影響することが示唆された。また、α1N末端は他のサブユニットとの相互作用を促進し、PI31必須なタンパク質の分解を活性化している可能性が示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Structural determinants in GABARAP required for the selective binding and recruitment of ALFY to LC3B-positive structures. (2014)
  • 著者名/発表者名: Lystad AH, Ichimura Y, Takagi K, Yang Y, Pankiv S, Kanegae Y, Kageyama S, Suzuki M, Saito I, Mizushima T, Komatsu M, Simonsen A.
  • 雑誌名: EMBO report 巻: 15 ページ: 557-565
  • DOI: 10.1002/embr.201338003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pba3-Pba4 heterodimer acts as a molecular matchmaker in proteasome α-ring formation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Takagi K, Saeki Y, Yashiroda H, Yagi H, Kaiho A, Murata S, Yamane T, Tanaka K, Mizushima T, Kato K
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 450 ページ: 1110-1114
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.06.119
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bacterial effectors and their functions in the ubiquitin-proteasome system: insight from the modes of substrate recognition. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kim M, Otsubo R, Morikawa H, Nishide A, Takagi K, Sasakawa C, Mizushima T
  • 雑誌名: Cells 巻: 3 ページ: 848-864
  • DOI: 10.3390/cells3030848
  • 査読あり
• [雑誌論文] N-terminal α7 deletion of the proteasome 20S core particle substitutes for yeast PI31 function. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yashiroda H, Toda Y, Otsu S, Takagi K, Mizushima T, Murata S
  • 雑誌名: Molecular and Cellular Biology 巻: 35 ページ: 141-152
  • DOI: 10.1128/MCB.00582-14
  • 査読あり
• [学会発表] 赤痢菌エフェクターIpaH9.8基質認識ドメインのX線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 高木賢治、Kim Minsoo、笹川千尋、水島恒裕
  • 学会等名: 新学術領域研究「ユビキチンネオバイオロジー」平成26年度領域班会議
  • 発表場所: ホテルたつき（愛知県蒲郡市）
  • 年月日: 2014-12-03 – 2014-12-05
• [学会発表] Structure and substrate recognition mechanism of IpaH9.8 LRR (2014)
  • 著者名/発表者名: Kenji Takagi, Akira Nishide, Tsunehiro Mizushima
  • 学会等名: Symposium for young ubiquitin researchers ina Japan "New Era in the Ubiquitin Research"
  • 発表場所: 国際高等研究所（京都府木津川市）
  • 年月日: 2014-11-11 – 2014-11-12
• [学会発表] 赤痢菌エフェクターIpaH9.8基質認識ドメインのX線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 高木賢治、水島恒裕
  • 学会等名: 日本結晶学会平成26年度年会
  • 発表場所: 東京大学（東京都文京区）
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-03