| 研究課題/領域番号 |
25870714
|
|---|
| 研究種目 |
若手研究(B)
|
| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
|---|
研究代表者 |
大谷 直人 慶應義塾大学, 政策・メディア研究科, 特任講師 (70365451)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
|
| キーワード | 高度好熱菌 / Thermus thermophilus / 染色体 / DNA複製 / 倍数体 / メガプラスミド |
|---|
| 研究概要 |
高度好熱菌Thermus thermophilus HB27を対象とし、細胞内に染色体を複数コピー有する倍数体バクテリアのDNA複製開始機構の解明を目指している。初年度は計画通りに染色体の複製開始領域の特定を試みた。高度好熱菌ゲノムのDNAライブラリーを構築し、これを用いて高度好熱菌を形質転換することで、自立的複製能を持つ（複製開始領域を含む）クローンのスクリーニングを行った。しかしながら、形質転換体の多くは、高度好熱菌の高頻度の組換え能により、クローンがゲノム中に組込まれてしまったものであった。プラスミド状として細胞内に存在した一部のクローンも、再度形質転換を行うと形質転換体は得られず、複製開始領域とは判断しがたい。高頻度の組換えを避けるため、DNA組換えに関わるrecA遺伝子を破壊した株で同様の実験を行ったが、複製開始領域と判断できうるクローンは得られていない。
染色体から0.1 Mbp程度の領域を環状でコピーアウトする手法によるアプローチも行っているが、こちらも高頻度のDNA組換えにより、コピーアウトした領域が再度ゲノムに組込まれるという結果となり、複製開始領域の特定には至っていない。コピーアウトにはDNA組換え能が必須であり、recA破壊株で行うことは不可能であるため、recA遺伝子発現のオンオフを制御できるような系の構築に着手している。
高度好熱菌には染色体の他に約230 kbpのメガプラスミドpTT27が存在する。染色体のモデルケースとして、メガプラスミドの複製開始領域の解析を行った。プラスミド上の領域を段階的に欠失していくことで、pTT27の複製に必要な最小領域（ミニマムレプリコン）を特定した。pTT27のミニマムレプリコンは、プラスミド上で約100 kb離れた場所に位置する２つの領域により構成されており、詳細は解析中である。染色体の複製開始も、離れた位置に存在する複数の領域が関わる可能性が有り得る。
|
| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
3: やや遅れている
理由
高度好熱菌T. thermophilusを対象とした倍数体バクテリアのDNA複製開始機構の解明において最も重要なのは、複製開始領域を特定することである。これを是が非でも成し遂げなければ本課題の達成は有り得ない。残念ながら、初年度の研究実績においては未だその特定には至っていない。ライブラリーからのスクリーニングでは１クローンがカバーできるDNAサイズは数十 kb程度であり、pTT27メガプラスミドの解析からの知見のように、100 kb以上も離れた距離に位置する複数の領域が複製開始に関わるような場合、この方法は有効ではない。recA破壊株を用いたライブラリーからのスクリーニングでも目的のクローンが取得できていないのは、そのような理由からではないかと推測している。しかしながら、pTT27で行ったような段階的に領域を欠失させていくというアプローチもまた、染色体上には多くの必須遺伝子が存在するため、不向きと考えられる。以上のことから、染色体から100 kb以上の領域をコピーアウトし、それが自立的に複製できるのかどうかを検証する方法が有効であろうという結論に達した。このためにはrecA遺伝子発現が制御可能な系の構築が不可欠であり、それに着手している。
本研究の将来的な目標の１つとして、倍数体バクテリアの染色体複製機構を一倍体バクテリアと比較することで、細胞内の染色体のコピー数を自在に制御できる系を構築したいと考えている。メガプラスミドpTT27の複製開始領域の解析の過程において、このプラスミドが欠落した高度好熱菌の取得に成功している。詳細な解析はこれからとなるが、このpTT27欠落株では染色体DNAの量が野生型に比べ減少しているような傾向が見られた。pTT27上の因子が染色体のコピー数に影響を及ぼす可能性が推測され、染色体コピー数制御系構築の布石として重要な知見となるかもしれない。
|
| 今後の研究の推進方策 |
高度好熱菌染色体の複製開始領域の特定を目指す。染色体から0.1 Mbp程度の領域を環状でコピーアウトするという手法を用いて、コピーアウトされた部分に複製開始領域が含まれる場合のみそれが複製し、プラスミドとして存在できるような系を構築する。高度好熱菌用のクローニングベクターの複製起点近傍にrecA遺伝子とマーカー遺伝子を配置し、このベクターと染色体との間のDNA組換えにより特定領域をコピーアウトする。期待するDNA組換えが起こった際には、ベクター由来の複製起点、recAおよびマーカー遺伝子が目的の領域に置き換わる仕組みであり、宿主としては高度好熱菌recA破壊株、マーカーとしてはストレプトマイシン耐性遺伝子を用いる。この耐性遺伝子は、それが存在する限り、細胞はストレプトマイシン依存的な生育を示すと報告されたもの(Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73(16):5138-5145)を用いる。したがって、目的の組換えが生じて耐性遺伝子が消失することで、ストレプトマイシンを含まない培地で生育できるようになるため、目的の組換え体の選択が可能となるはずである。このとき同時に組換えに関わるrecA遺伝子も消失することとなり、recAの制御が実現できる。
予想外に複製開始領域の特定に困難を極めているため、別のアプローチのための系の確立を余儀なくされている。複製開始領域が特定できれば、遅れは生じてはいるものの、当初の計画通りの方針で研究を推進する予定である。
染色体複製開始のモデルケースともなるため、引き続きメガプラスミドpTT27の複製開始機構の解析も行う。メガプラスミドと染色体コピー数との関係にも注目して解析を進め、関係があるのであれば、それに関わるメガプラスミド上の因子を明らかにしたい。将来的な染色体コピー数制御系開発の布石としたい。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
予定していた研究計画よりも研究の進展に遅れが生じたため、平成25年度に使用を予定していた実験試薬、実験器具、実験用消耗品類の購入を控えていた。研究の進展に伴い、平成26年度にこれらの研究用物品を購入したいと考えている。
研究の進展が遅れてしまったため、平成25年度に予定していた研究計画を平成26年度に実施することになった。そのため、平成25年度に使用を予定していた実験試薬、実験器具、実験用消耗品類の購入を平成26年度に行うこととなり、平成25年度に使用予定であった物品費をこれに当てる。
|
