| 研究課題/領域番号 |
25871124
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
中西 慶子 独立行政法人理化学研究所, 小林脂質生物学研究室, 協力研究員 (30415252)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 細胞分化 / 小胞体ストレス / 筋発生 / 小胞体膜動態 / カルシウム |
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| 研究実績の概要 |
筋前駆細胞である筋芽細胞が筋蛋白質を発現する筋管細胞に分化する過程で、一過的に小胞体ストレス応答が生じ、これが筋分化過程において重要な役割を果たしていることを私たちは以前報告した。この分化過程に組込まれた生理的小胞体ストレスの発生源が小胞体内カルシウム枯渇であることを強く示唆する結果を得、この内容について昨年度の報告書に記載した。今年度は筋分化時における小胞体内カルシウム枯渇を可視化し、直接的に証明することを試みた。
小胞体膜貫通蛋白質STIM1は小胞体内カルシウム濃度低下によって構造変化を起こし、小胞体膜の一部とともに細胞膜直下へと移動する。蛍光蛋白質を付加したSTIM1を筋芽細胞に導入し、小胞体内カルシウム涸渇による細胞膜への移動を察した。その結果、筋分化誘導後約1日（24時間前後）において、小胞体内カルシウム枯渇特異的に観察されるSTIM1のドットパターンが現れた。また、薬剤を用いて小胞体内カルシウム枯渇を人為的に誘導した際には、1時間以内に同様のドットパターンが観察され、この系が正しく機能していることも確認された。これにより、筋分化時に小胞体内カルシウム枯渇が確かに生じること、またそのタイミングが明らかになった。これにより研究計画I-2「小胞体内カルシウム涸渇によって変化する小胞体膜上蛋白質の観察」は達成された。更にここまでの研究結果を論文として誌上発表した。
筋分化時の小胞体内カルシウム枯渇のタイミングが明らかになったことにより、研究計画II-1「筋分化過程における小胞体ストレス応答と筋分化制御系を繋ぐ分子の同定」において、マイクロアレイサンプルとして用いるべき筋分化誘導細胞の回収タイミングが特定できた。小胞体内カルシウム枯渇が生じる24時間から、小胞体ストレスが持続する48時間の間の筋分化誘導後36時間を解析ポイントとして選定し、マイクロアレイ解析を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画I-2「小胞体内カルシウム涸渇によって変化する小胞体膜上蛋白質の観察」が達成されたことにより、筋分化過程において小胞体内カルシウムが低下することを直接的に示すことに成功した。またこれにより筋分化過程における小胞体内カルシウム枯渇が生じるタイミングが明らかになり、研究計画II-1「筋分化過程における小胞体ストレス応答と筋分化制御系を繋ぐ分子の同定」に着手することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
マイクロアレイ解析で抽出した分化制御候補因子について機能解析を行う。得られた候補分子をクローニングし、培養筋芽細胞に過剰発現させ、分化誘導条件下で促進効果（発現が減少するタイプの候補分子については抑制効果）を示すものを同定する。また候補分子に特異的なCRISPR-Cas9システム発現ベクターを細胞に導入して特定遺伝子のノックアウトを行う。分化に対して抑制効果（発現が減少するタイプの候補分子については促進効果）を示すものを選別することで、筋分化制御に必須な分子の同定を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
H25年7月よりH26年1月までの7ヶ月間、理化学研究所 発生・再生科学総合研究センターに出向していたことにより、当初の研究計画と比較してずれが生じている。これにより25年度分の研究費の一部が26年度分に繰り越された結果による。
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| 次年度使用額の使用計画 |
繰越し分に関しては、26年度分の消耗品費として請求していた遺伝子導入試薬、抗体類にかかる費用分であり、これは27年度の研究計画において実施する。
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