| 研究課題/領域番号 |
25871128
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
高井 啓 独立行政法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 特別研究員 (60637205)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | ライブイメージング / ルシフェラーゼ / RNAイメージング / シグナル伝達 |
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| 研究概要 |
RNA結合タンパク質MS2とPP7を用いたmRNA可視化法については、①MS2ステムループおよびPP7ステムループを3’UTRに導入した標的mRNAの発現プラスミド、②分割型ルシフェラーゼのN末・C末とMS2・PP7との融合タンパク質の発現プラスミドをそれぞれ作製し、標的mRNA依存的な分割型ルシフェラーゼの発光が見られるかどうかを検討した。①に関してはMS2ステムループとPP7ステムループ間のRNA塩基の長さを検討し、さらにMS2ステムループ/PP7ステムループのセットを標的RNAに複数個導入することで、良好な予備的結果を得た。②に関しては分割型ルシフェラーゼのN末・C末とMS2・PP7との組み合わせ、融合する方向、および融合する際のリンカーペプチドの種類を検討し、得られるシグナル強度およびS/Nの改善に成功した。しかしながら依然として標的mRNA非依存的なバックグラウンドの発光シグナルが残っているため、今後さらなるバックグラウンドの低減化に取り組む。
複数mRNAの同時可視化のためのルシフェラーゼの高輝度化・多色化については、大阪大学永井健治研究室との共同研究により、高輝度発光タンパク質Nano-lanternをベースに新たな高輝度かつ発光波長の異なる発光タンパク質の開発に成功した。さらにこれらを培養細胞において遺伝子発現レポーター、および細胞内構造のイメージングプローブとして使用することで、マルチカラー発光イメージングに成功した。今後これら多色化Nano-lanternを、複数mRNAの同時可視化用プローブとして使用する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画当初には予期しなかった問題点も多くあるが、着実に改善でき成果が得られているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
おおむね予定通りの進捗状況であるため、次年度も計画に沿って着実に開発を進めていく予定である。
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