| 研究課題/領域番号 |
25871145
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
梅木 伸久 独立行政法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 研究員 (70647502)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | Ras / 構造多型 / 細胞内情報伝達 / 1分子計測 / 低分子量G蛋白質 |
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| 研究実績の概要 |
細胞増殖・分化を制御する低分子量Gタンパク質「Ras」は細胞外からの刺激をうけて活性化し、様々な標的タンパク質と相互作用する事によって下流へと情報を伝達する。本研究ではRasが持つ構造多型性の生理的意義を明らかにする為に、１分子計測技術を用いて標的タンパク質との相互作用を、試験管内・細胞内の両実験系において解析する。
H26年度は、ガラス基板上に貼付けたRasと溶液中のRas結合タンパク質との相互作用を、１分子蛍光観察できる系の構築を行った。蛍光標識したRas結合タンパク質のガラス基板上への非特異的吸着を防ぐ為に、当初はBSA/カゼインによるブロッキング法を採用していたがそれでは不十分であった。そこでさまざまなブロッキング法を検討した結果、人工脂質膜を用いる系が最適である事がわかった。GODS-Ni-NTAとPOPCを混合して作成したリポソームをガラス基板上へ展開し、脂質二重膜を構成する事に成功した。RasはHisタグを介して脂質膜上に固定した。１分子解析する際にRas蛋白質が固定されている方が望ましい場合には、POPCの代わりにDPPC（相転移温度(Tm値)がPOPCと比べて高い）を用いる事でRasの膜上での流動性が抑えられる事がわかった。RasとRalGDの結合時間・解離時間のヒストグラムをそれぞれ作成し、どちらも２つの指数関数の和でフィッティングされる事がわかった。この事はRasに対するRalGDSの結合・解離反応には少なくとも二つの様式がある事を示唆している。今後詳細に解析していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H26年度末までに、細胞内・試験管内における1分子計測の為の系の立ち上げ（発現ベクターの構築・蛋白質調製・蛍光標識とその評価・顕微鏡システムの立ち上げ等）を行う予定であったが、おおむね完了したと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
試験管内・細胞内における両実験はおおむね順調に進展しているが、研究をさらに加速するために他の研究者と今以上の情報交換を心掛ける。特に研究室内には細胞内１分子蛍光観察の専門家および顕微鏡のメンテナンス・組み立て・最適化を行う専門家がいるので、彼らのアドバイスを適宜受け研究を行う予定である。また余剰金を利用し、画像を解析する為のソフトウエア・解析機器等を新たに購入して研究を加速させる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画では高感度CMOSカメラを本研究予算で購入・設置の予定であった。またブロッキング法の確立の為に、多額の消耗品費が必要の予定であった。しかし研究室の他の予算で他の目的の為に購入したものを、本研究にも使用する事が出来たので、結果的に余剰金が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
引き続き、蛍光試薬・人工脂質などの高額な消耗品費に充当する。また１分子観察した画像を解析する為のソフトウエア・解析機器等を新たに購入し研究を加速させる。
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