| 研究課題/領域番号 |
25871145
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
梅木 伸久 国立研究開発法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 研究員 (70647502)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | Ras / 構造多型 / 一分子計測 / 細胞内情報伝達 / RalGDS / 低分子量Gタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、Rasがもつ構造多型性の生理的意義を理解するために、１分子計測技術をもちいて標的タンパク質との相互作用を試験管内・細胞内の両実験系において解析する。細胞内におけるRasとその標的タンパク質であるRalGDSとの相互作用を１分子蛍光観察するために、Haloタグを付加したRalGDSをHeLa細胞に発現させ、TMRで蛍光標識した。全反射蛍光顕微鏡をもちいて、EGF刺激前後における個々のRalGDS分子を観察したところ、RalGDSはミリ秒～秒オーダーで細胞膜との結合・解離を頻繁に繰り返していることが明らかとなった。この結合時間に対するヒストグラム（RalGDSの膜滞在時間分布）を作成したところ、２つの指数関数の和でうまくフィットできることがわかった。このことはRas-RalGDS間相互作用には少なくとも2つの様式があることを示しており、以下の2つのいずれかに起因するものと考えられた。(1)細胞内のRasにはGTP結合型とGDP結合型の２種類が共存しており、それらに対するRalGDSの相互作用（解離速度時定数）が異なっていた。(2) GTP結合型のRasにも２つの異なる構造状態があり、それぞれに他するRalGDS分子の相互作用が異なっていた。
2つの結合様式の割合（Rasから比較的早く解離する成分と、遅く解離する成分の割合）は刺激前後で変化しなかったことから、(2)の可能性が高いものと考えられた。これをさらに検証するため、試験管内実験も行うこととした。まずビオチン-アビジンの系を利用してRasをガラス基板上に再構成した。加水分解されないGTPの誘導体を取り込ませたRasに対するRalGDSの結合・解離反応をモニターすることに成功し、そこから結合時間分布を作成した。その結果、試験管内実験においても２つの指数関数の和でフィットできることがわかった。よって活性型であるGTP結合型のRasには少なくとも2つの構造状態があり、それぞれの構造をとるRasに対するRalGDSの相互作用が異なるものと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞内・試験管内の両実験系により、GTP結合型のRasには少なくとも２つの構造状態があることが明らかとなり、それぞれの構造状態におけるRasに対するRalGDSの相互作用は異なっていることがわかった。しかし、それがRasの生理機能にどう関わっているかは未だ不明で、更なる実験が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究をさらに加速するために他の研究者と今以上の情報交換、特に学会発表等を通じての情報交換を積極的に行う。余剰金を利用し、画像を解析するためのソフトウエアを新たに購入して研究を加速させる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
細胞内・試験管内の両実験系により、GTP結合型のRasには少なくとも２つの構造状態があり、それぞれの構造状態におけるRasに対するRalGDSの相互作用は異なっていることが本研究により明らかになった。しかし、それがRasの生理機能にどう関わっているかは未だ不明で、更なる実験および解析が必要である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
余剰金は消耗品類に充当する。また研究を加速させるため、解析ソフトウエアの購入に使用する。
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