| 研究課題/領域番号 |
25871247
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 独立行政法人酒類総合研究所 |
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研究代表者 |
水谷 治 独立行政法人酒類総合研究所, その他部局等, 研究員 (10443996)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 遺伝子組換え / Aspergillus oryzae / マーカーリサイクリング / Cre/loxP システム / 人工ヌクレアーゼ (TALEN) |
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| 研究概要 |
現在までに部位特異的組換え酵素 (Cre) を、核酸 (DNA) を酵素キャリアとする事で麹菌細胞内に直接導入することに成功し、ターゲット配列 (loxP) 間に挟まれた遺伝子を、従来より簡便に除去できる方法を開発している。本研究では、Cre 酵素を麹菌細胞内に直接導入し機能させるために、核酸が酵素キャリアとしてなぜ必要なのかを明らかにしようとしている。Cre 酵素の細胞内への取り込みは、キャリアである核酸との相互作用を介し、更に細胞膜と核酸の相互作用によりエンドサイトーシスにて取り込まれていると予想している。そこで、Cre 酵素に対して、キャリアである核酸がどのような効果をもたらしているかを調べた。しかしながら、明確な結合作用等確認することが出来なかった。今後、より詳細な解析を行うとともに、Cre 酵素抗体等を利用し、蛍光顕微鏡を用いて視覚的に Cre 酵素の取り込みの様子を観察する予定である。また、酵素キャリアの種類について検討を行ったところ、二本鎖又は一本鎖 DNA だけでなく rRNA でもキャリアとなりうることを明らかとした。今後は、他にも酵素キャリアとなりうる物質の探索を行うとともに Cre 酵素単独でも細胞内に導入出来る変異体の作製を検討する。さらに本研究では導入酵素を Cre だけでなく、人工ヌクレアーゼ (TALEN) でも応用が可能かに挑戦し、遺伝子組換え体でない有用菌株の造成技術の開発を目指している。そこで最初の取り掛かりとして、ターゲットを麹菌の硫酸塩資化に必要な ATP sulfurylase (sC) 遺伝子に決定し、その標的配列の決定と TALE リピート配列の設計を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
酵素キャリアの検討や TALEN に関しては進んでいるが、麹菌細胞内に Cre 酵素を導入するために、核酸が酵素キャリアとしてなぜ必要なのかに関する研究において、考察出来る結果が得られていないため、”やや遅れている” とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
概ね当初の実験計画に従って研究を進めていく予定。しかしながら、Cre 酵素の直接同入に関する研究が遅れているため、重点的に行うとともに、うまくいかない場合は、麹菌より扱いが簡便な酵母等の微生物でも研究を進めていく。また、TALEN の作製を行い、まず麹菌で正常に機能するかを確認するとともに大腸菌等により発現、精製を試み、TALEN を麹菌細胞内に直接導入出来るかの準備を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
Cre 酵素に対して、キャリアである核酸がどのような効果をもたらしているかを調べる実験において、考察が出来るような結果が得られなかったため、Cre 酵素にどのような変異を入れるべきか等の研究における準備が整わず、その分の研究消耗品費の使用が出来なかったことにより次年度繰越しが生じてしまった。
本繰越額は次年度の研究費とあわせ、今後の研究に必要な消耗品（分子生物学用試薬や実験器具等）に使用する。また、精製 TALEN 等を得るために TALEN プラスミド作製サービスを利用することも計画している。
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