|
AMPA-Rは、長期増強（Long-term potentiation: LTP）において、シナプス後膜においてその数が増加することが指摘されており、実際にシナプス可塑性の主要な一因を果たしていると考えられている。その数の増加は、同受容体の細胞内から細胞外への挿入とそれに続く側方拡散によってシナプス後膜に集積することによってなされる。つまりシナプス後膜に特異的に集簇したAMPA-Rを標識することでシナプス可塑性をモニターすることが可能である。
そのためにシナプス後膜に存在し、AMPA-Rと複合体を形成するタンパク質PSD-95を利用した。PSD95の近傍にあるAMPA-Rのみを可視化することができれば、シナプス後膜特異的にAMPA-Rを半定量することが可能である。特定部位で切断したVenusの断片をそれぞれAMPA-R とPSD95 に結合させたものを作製し、HEK細胞やラットの初代神経細胞にそれらを共発現させた。AMPA-RとPSD95が近傍に位置し複合体を形成すれば、Venusタンパクが再構築され蛍光を発するはずである。
初年度はHEK細胞ならびにラット神経初代培養細胞を用いて、chemical LTDおよびchemical LTPにてこのシステムが働くことを確認した。具体的にはsplit Venusを付属させたAMPA-RとPSD-95が神経細胞内で正常なlocalizationをとること、また両者がcolocalizationする箇所のみVenusの信号が確認される事を確認した。さらにVenusの切断部位を様々に検討し、LTDおよびLTPの同定に最適な切断部位を同定した。その結果chemical LTDおよびchemical LTPに対して鋭敏に反応する組み合わせを見いだす事に成功した。現在はゼブラフィッシュの樹立中である。
|
