| 研究実績の概要 |
ショ糖密度勾配遠心法を用いることにより, 植物RISCが翻訳のどの段階を阻害しているかを解析した. その結果, 植物RISCは翻訳の開始段階を阻害することが明らかとなった. 次に, RISCがORFに結合した場合, 翻訳伸長を阻害しているかを調べるために, N末端にFLAGタグを持ちORFに標的配列を持つmRNAを設計した. もしRISCがORF上でリボソームの進行を止めることができるのであれば, FLAGタグに対するウエスタン解析によって, N末端から標的配列までのアミノ酸からなる不完全な長さを持つタンパク質断片が蓄積するはずである. この仮説を支持するように, 標的配列に完全に相補的なmiRNAをプログラムしたRISCを加えた場合, おおよそ標的配列までの長さのタンパク断片の蓄積が認められた.この結果はリボソームが標的配列の直前で止まっていることを示唆する. 以上より植物RISCは翻訳開始を抑制するとともに, ORFに結合した場合, 翻訳の伸長も阻害することが示唆された.
繰越分に関して
実際にRISCがリボソームの進行を止めているかを調べるためにリボソームフットプリンティングを行った. 次世代シークエンスを用いる代わりに, 放射線標識した標的RNAとDNAアレイを用いることによりリボソームが標的mRNAのどの部分に結合しているかを簡便・高感度に確かめることができる実験系を作成した. しかしながら研究の過程でリボソームフットプリンティング法では標的配列の上流でリボソームが実際に止まっているかどうかを検証することが困難であることが明らかになった.そこでリボソームが正常に解離しない場合に生じるペプチジルtRNAを検出することのできるNuPAGE法を用いることで上記の問題の解決を計った.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
独自に開発した植物の試験管内翻訳抑制系を用いた生化学により, 植物RISC特有の翻訳抑制機構を解明するという本研究の目的を踏まえ, 今年度は, ショ糖密度勾配遠心を用いて植物RISCが翻訳のどの段階を阻害しているかを解析した.試験管内翻訳抑制系とショ糖密度勾配遠心法の組み合わせにより, 植物RISCがORF中でリボソームの進行を止めることが示唆されたことは, 動物RISCとは異なる植物RISC特有の翻訳抑制を明らかにする上で大きな発見であったといえる.これまでの研究と本年度の結果を論文として発表できたことからも, 当初の研究計画に即して本研究はおおむね順調に進展しているといえる．
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