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DNA複製フォークは染色体の倍加に必須な構造であるが、大変脆弱であるという一面をもち、DNA二本鎖間架橋(ICL)など鋳型上の様々な傷害が原因で、構造的に崩壊する。DNA合成の再開には、フォークを再生する必要があるが、その機構に関して高等生物ではほとんど分かっていない。本研究では、ヒト細胞における次世代細胞遺伝学を確立しつつ、それを最大限に活かして複製フォークの再生機構の解析を行った。前年度には、構築したヒトMCM8およびMCM9遺伝子破壊株の解析から、Mcm8-9は、ICL修復時の相同組換えの後半、つまりフォークの再生において役割があることが明らかとなっていた。
まず、前年度に引き続き、ヒト細胞におけるゲノム編集技術の応用を進めた結果、ヒトHCT116細胞株にて、CRISPR/Cas法による遺伝子のノックアウトやノックイン（内在性遺伝子のGFPタギング等）が容易にできるようになり、これまで酵母等の一部の生物種のみで可能であった詳細な分子細胞遺伝学的な解析が可能になった。
次に、この成果を活用し、Mcm8-9のICL修復以外でのフォーク再生における役割の解析を進めた。具体的には、フォークの構成因子であるMcm2の内在性遺伝子に、オーキシン誘導デグロンを付加した細胞株を構築し、オーキシン添加後数時間以内にMcm2タンパク質を分解することを可能にした。分解後、細胞のDNA合成は瞬時に停止し、DNA二重鎖切断(DSB)の初期マーカーであるγ-H2AXのフォーカスが多数核内に蓄積した。興味深いことに、このフォーカスには、組換え因子のRad51に加え、Mcm8も共局在することが明らかとなった。これらの結果から、ICL修復以外にも、Mcm8-9がフォークの再生において重要な役割を果たしていることが分かった。今後、この系を用いて、フォーク再生メカニズムのさらなる詳細な解析が期待される。
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