|
本研究は、人工ヌクレアーゼであるCAS9/gRNAシステム（CRISPR/Casシステム）を利用したゲノム改変動物の作製法について、応用的な利用法の開発を目的として行った。
はじめに、申請者がこれまでに確立した受精卵を介した高効率ゲノム改変が可能なシステムによって、複数遺伝子の破壊がどの程度の効率で行えるのかを検討した。3遺伝子を同時に対象にした場合、ほぼ全ての産子がトリプルノックアウトとなり、これらはＥＳ細胞を用いた従来法によるノックアウトマウスと同様の表現型を示したことから、このゲノム改変系が複数座位のゲノム改変動物の作製に有効であることが明らかとなった。続いて、人工ヌクレアーゼによるゲノム改変の課題となっている「オフターゲット効果」に対する回避法を検討するために、培養細胞で報告されているCAS9ニッカーゼとペアのgRNAによるオフセットニッキング法（ダブルニッキング法）がゲノム改変動物作製においてもオフターゲット回避に有効であるかを検討した。その結果、この方法は通常のCAS9ヌクレアーゼを利用した場合に認められたオフターゲット変異を回避しつつ、高効率にゲノム改変個体の作製が可能であることが明らかとなった。更に、このゲノム改変法を利用し、特定ゲノム領域の欠失、ペプチドタグなどの塩基配列のノックイン、1～数塩基の置換などを行ったマウスの作製が可能であり、こうしたゲノム改変はラットにおいても有効であることを明らかとした。
以上より、申請者の確立した高効率CAS9/gRNAシステムを応用したオフセットニッキング法によって、オフターゲット変異を回避しつつ高効率に複雑なゲノム改変を施した動物を作製可能であることが明らかとなった。
|
