| 研究課題/領域番号 |
25893150
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| 研究種目 |
研究活動スタート支援
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
張 影 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10711260)
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| 研究期間 (年度) |
2013-08-30 – 2015-03-31
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| キーワード | 血管病 / 血管攣縮 / 病的シグナル伝達 / 血管平滑筋 |
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| 研究概要 |
血管異常収縮シグナル伝達『SPC→Fyn→Rhoキナーゼ』経路において、Fyn活性化からRhoキナーゼ活性化に至る機構については不明なままである。本研究では、活性型Fynと結合したタンパク質群の中から、質量分析計で新規Fyn下流分子を同定する。更に、候補新規Fyn下流分子と活性型Fynの結合を確認するため、細胞内実験系(①免疫染色による細胞内局在、②免疫沈降による活性型Fynとの直接結合)とin vitro実験系(組換えタンパク質を用いた、表面プラズモン共鳴法による分子間の直接の相互作用解析)により全面的に検証する。本年度は以下の研究成果を得た。
1.高感度タンデム型質量分析計(MALDI TOF-MS/MS)を用いた機能プロテオミクスにより、活性型Fynと結合したタンパク質群から新規Fyn下流分子を同定した。
2.免疫染色法により細胞内で活性型Fynと新規分子の細胞内の共局在した事を蛍光顕微鏡で観察した。
3.免疫沈降法を用いて、新規分子とFynの相互作用を確認した。
4.in vitroで新規分子の組換えタンパク質と組換えFynを発現・精製して、表面プラズモン共鳴法による分子間相互作用解析装置で新規分子とFynの相互作用を確認した。
5.Rhoキナーゼの活性化の指標としてMYPT1の853番目のスレオニンのリン酸化をWestern Blotで調べた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、スフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)による血管平滑筋異常収縮シグナル伝達『SPC→Fyn→Rhoキナーゼ』経路の中で、全く未解明のFynとRhoキナーゼの間の分子機構に着目し、研究計画に沿って研究を遂行できている。具体的には、（１)Fyn下流新規シグナル分子を質量分析計で同定した。（２）細胞内実験系で新規分子とFynの作用を確認した。（３）in vitro実験系で新規分子の組換えタンパク質と組換えFynの相互作用を検討した。以上より、本研究は、概ね順調に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究は順調に進行しており、現時点では問題点を見出していない。血管平滑筋異常収縮の新規シグナル分子である事が検証できた新規Fyn下流分子について、研究計画の通りに、細胞・組織・生体レベルで機能解析を進めたい。
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