| 研究実績の概要 |
「臨床試験」および購入骨髄からの検体を合わせN=30（目標N=20以上） のドナー骨髄が得られた。計画ではP1、P4、P7の検討を行う予定だったが、現行の培養方法で必要な日数や費用など臨床利用の観点から、P1の解析のみに修正した。我々が今回骨髄細胞用に選定したロットのウシ血清（FBS）を用い、①10％FBS, ②5%FBS, ③5％FBS+10ng/ml bFGFの条件で培養させた場合、P1における倍加指数はそれぞれ①0.22±0.08(PD/d), ②0.16±0.08(PD/d), ③0.35±0.14(PD/d)で、さらに軟骨分化誘導後のペレットの湿重量は①0.82±0.67（mg）, ②0.82±0.72（mg）, ③3.42±1.06（mg）であった。生化学試験や免疫染色を含めbFGFの反応性については従来の報告と同様の定性的な結果が得られ、各ドナーにおける定量指標も独自に得られた。実験の妥当性とその後の解析に十分なサンプルサイズが得られたと判断した。
これを踏まえ、軟骨分化誘導前のRNAプロファイリングをmicroarrayシステム（EXIQON社miRCURY LNA miRNA array）で網羅的に解析し、増殖期のbFGFの反応性を含めた各ドナーの軟骨分化度のマーカー候補となりうるmicroRNAをいくつか抽出した。定量PCRによる検証の結果、条件①の軟骨分化後の湿重量1㎎を境にした群間比較でmiR708-5pの発現が1mg以上群で有意に低く、本遺伝子が軟骨分化誘導に抑制的に関与することが示唆された。しかし1mg以下群内でのバラつきは大きく、これらは他遺伝子の関与を示唆した。今後、bFGF処置細胞のmiR708-5pの発現量とともに他遺伝子についても更なる検討を要する。
次世代シーケンサーを用いたRNA-Seqによる解析および臨床成績との比較は現在進行中である。
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