| 研究課題/領域番号 |
26000011
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
河田 聡 大阪大学, 工学研究科, 教授 (30144439)
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| 研究分担者 |
野地 博行 東京大学, 工学系研究科, 教授 (00343111)
藤田 克昌 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (80362664)
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| 研究期間 (年度) |
2014 – 2018
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| キーワード | 細胞内分子イメージング / ラマン分光 / 表面増強ラマン散乱 / 超解像イメージング / 細胞内センシング / 機能性分子 / スペクトル解析 / 金属ナノ粒子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究計画では、細胞内分子イメージングのための「3次元・ナノ・分析・光学」顕微鏡を開発することを目的としており、昨年度には下記の4つの研究実績を達成した。
1、細胞内ナノ分析顕微鏡の開発
初年度に試作した単一金属ナノ粒子をプローブとした細胞内ナノ分析顕微鏡に蛍光画像計測を融合させたシステムを構築した。単一金属ナノ粒子からの増強ラマン散乱光を追跡しつつ、細胞内構造の蛍光画像計測により空間情報を補うことで、細胞内の分子検出および局所環境の分析を進めている。また細胞全体に変化を起こす生命現象や薬剤送達による細胞応答を分析するため、細胞全体を観察可能な多粒子並列計測システムの設計、試作も行った。
2、金属ナノ粒子の作製、および選定
高い増強効果をもつ銀ナノ粒子を細胞内環境で使用するために、銀ナノ粒子を金薄膜で覆った構造をもつハイブリッドナノ粒子を試作した。また初年度に作製した金属ナノ粒子も含め、ラマン分光計測による選定実験を進めたところ、当初予定していた波長域よりも短い波長域での励起によりさらなる増強効果が得られる可能性を見出した。
3、環境センシングにおける検出対象および機能性分子の探索
増強ラマン散乱スペクトルの計測による、pH、ATP、代謝生成物の検出を行った。pHに関してはpMBAおよびECCP、ATPについてはATP合成酵素のεサブユニット、酵素活性についてはそれぞれセンサー分子として用いた。また代謝生成物に関しては、プリンヌクレオチド代謝経路における各生成物を、増強ラマン散乱スペクトルから識別可能であることを確認した。
4、スペクトル分析・画像構築技術の開発
初年度に開発したスペクトル解析ソフトウェアの制御装置への組み込み作業を進めた。制御ソフトウェアと連動させるために、測定したラマン分光画像から目的とするスペクトルを抽出するソフトウェアを新たに構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでのところ研究の進展に大きな問題はないが、本研究で得られる基礎データの包括的かつ定量的な解析手法を確立する必要がある。開発した顕微鏡で得られるデータは空間、時間、およびスペクトル(波長)の多次元であり、また計測条件(励起波長、照明方法)や試料条件(粒子形状、材質、機能性分子、標的分子)を可能な限り多くスクリーニングするため、得られる基礎データの量は膨大である。開発した解析ソフトウェアを駆使し、定量的で有益な情報を抽出し、全ての基礎データを包括した解析を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
試作した単一金属ナノ粒子を用いた顕微鏡の時間分解能の向上と励起光源の増加を主とする改良を進める。時間分解能は増強ラマン散乱光の強度にも依存しているため、顕微鏡開発グループとナノ粒子開発グループで連携し、最終目標である1ミリ秒の達成を目指す。またナノ粒子の選定実験から、当初想定していたよりも短い励起波長域の使用によりさらなる増強効果が得られる可能性を見出したため、現システムへの短波長光源の組み込みを予定している。開発途中である多粒子並列計測型の顕微鏡については、約百の粒子からのラマン散乱光を分光することを目標として、場合により低収差分光器をもう一台加えた2次元分光光学系を構築する予定である。また上記2種類の顕微鏡を組み合わせ、観察すべき範囲を多粒子並列計測により見極め、単一粒子計測により詳細にその部位をイメージングするという相補的な使用により、非常に大きなダイナミックレンジをもつイメージング手法を実現することも検討している。また開発した顕微鏡システムと機能性ナノ粒子を用いて、細胞内のタンパク質-生体分子相互作用(モータータンパク)、タンパク質-薬剤の結合の解析に応用する。
機能性ナノ粒子の作製については、pH、酵素活性、代謝物生成の検出に加え、主にラマン散乱活性が報告されている酸化還元電位センサーやイオンセンサーによる環境センシングも検討している。作製した金属ナノ粒子とも組み合わせ、光学効果の増強度、背景光の強さ、入射させるレーザー波長に依存した特性変化などを評価する。評価をクリアした機能性ナノ粒子については、順次細胞内構造と環境の同時イメージングへの利用を試みる。
解析技術の開発については、第一に装置制御ソフトウェアと解析ソフトウェアの連動化作業を引き続き行う。第二に、開発された主成分分析、クラスタリング、スペクトル間の相関をベースとする解析ソフトウェアを用いて、単一ナノ粒子計測や多粒子並列計測で取得される重畳したスペクトルデータの解析を進め、評価に伴い改良を順次行っていく予定である。
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