フォワードジェネティクスで同定した新規睡眠制御遺伝子による睡眠覚醒制御機構の解明

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26220207
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 柳沢 正史 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授 (20202369)
• 研究分担者: 上田 壮志 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (00599821) ; 高橋 智 筑波大学, 医学医療系, 教授 (50271896) ; 船戸 弘正 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授(WPI-IIIS) (90363118) ; Liu Qinghua 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 教授 (90723792)
• 研究期間 (年度): 2014-05-30 – 2019-03-31
• キーワード: 睡眠 / マウス遺伝学 / 神経生理学 / 生化学

研究実績の概要

1.リン酸化酵素SIK3の変異による睡眠量の増大と、明瞭な系統学的保存性。Sik3変異はエクソンをスキップするスプライス変異となる。スキップするエクソンがコードする52アミノ酸は脊椎動物間でよく保存されいる。この中には、ショウジョウバエや線虫でも保存されているPKAリン酸化部位が存在する。PKAリン酸化部位のセリンをアラニンに置換したSIK3を強制的に発現誘導させたところ、ショウジョウバエの睡眠様行動が延長した。
2. CRISPR法を用いたNalcn遺伝子改変マウスの作成と解析。同定したNalcn遺伝子変異のレム睡眠異常への因果性を証明するため、CRISPR法を用いて、Dreamless変異マウスに見出された1塩基変異をNalcn遺伝子に導入した。その結果、Dreamless変異マウスのレム睡眠短縮を再現することができた。
3. パッチクランプ法によるNalcn遺伝子変異神経の解析。Dreamless変異によるNALCN機能の変化を検討するために、野生型およびDreamless変異型のNALCNをHEK293細胞に発現させ、パッチクランプ法による電気生理学的な解析を行った。変異型NALCNは野生型に比べて顕著にイオン透過性が高まっていた。イオン選択性に乏しい点や膜電位非依存性である点については、野生型と同様であった。Dreamless変異マウス脳におけるレム睡眠制御神経の活動変化を明らかにすることが必須である。レム睡眠を抑制することが知られている中脳網様体のdeep mesencephalic nucleusをスライスパッチ法にて解析した。野生型に比べて、Dreamless変異マウスは記録中の平均膜電位が高く、発火頻度も高かった。レム睡眠エピソードの終止に関わる神経細胞群が過剰に活動するために、レム睡眠エピソードが短縮し、ひいては全レム睡眠時間が減少することを示唆している。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

以下の、当初研究に挙げたすべての項目について、現時点で順調に進展しており、いくつかの目標については予定以上のスピードで、または予想以上にインパクトのある結果が得られている。研究成果の一部は、昨年NATURE誌に掲載された論文にて公表した。
１ Sik3遺伝子変異マウスを用いた睡眠覚醒制御の細胞内シグナル伝達系の解明。FLAGタグを挿入した野生型および変異型SIK3ノックインマウスを作製しており、SIK3自身のリン酸化部位の定量的評価を行い、NATURE誌論文中にて公表した。これは当初の計画を超える研究の進展と言える。Sik3遺伝子変異マウス脳を用いたプロテオミクス、リン酸化プロテオミクス研究を実施し、現在投稿中である。
２ CRISPR法を用いたNalcn遺伝子改変マウスの作成と解析を目指して、Nalcn遺伝子にDreamless変異を導入したマウスを作製し、睡眠覚醒行動を評価した。このことにより、Nalcn遺伝子の変異によってレム睡眠短縮が生じることを証明しNATURE誌論文中にて公表した。
３ パッチクランプ法によるNalcn遺伝子変異マウス脳の解析。パッチクランプ法による、培養細胞を用いた野生型および変異型NALCNの解析を行った。また、レム睡眠を制御する中脳網様体内の神経核をターゲットに、野生型およびDreamless変異マウスのスライスパッチクランプ法による電気生理学的検討を行った。この結果は、NATURE誌に発表した。

今後の研究の推進方策

１．Sik3遺伝子改変マウスを用いた睡眠覚醒制御を司る神経回路の同定。Sik3 Ex13 floxマウスは、Cre依存的にExon13がスキップし、Sik3変異マウスと同様の覚醒時間の減少を示すかどうかを検討するために、全身的にCreを発現するAyu1-Creマウスと交配させた。得られたAyu1-Cre;Sik3 Ex13 floxマウスは、期待通りにEx13をスキップすることをゲノムDNA、mRNAおよび蛋白質レベルで確認した。このマウスの睡眠覚醒を検討したところ、Sik3変異マウスと同様の、顕著な覚醒時間の短縮を認めた。現在、Vglut1-Cre, Vglut2-Cre, Vgat-Cre, TH-Cre, CamKII-Cre, ChAT-Creとの交配を進め、睡眠覚醒のデータも得られている。インパクトのある研究成果とするため、脳領域特異的なCreドライバーとの交配を進める。研究期間内での発表を予定している。
２．Sik3遺伝子変異マウスを用いた睡眠覚醒制御の細胞内シグナル伝達系の解明
プロテオミクス、リン酸化プロテオミクス研究は、現在投稿中である。この研究を通じて、睡眠覚醒を制御する新しい候補蛋白質も得られているため、新たな研究計画を提案していく。
３．パッチクランプ法によるNalcn遺伝子変異マウス脳の解析
さらに研究を発展させるために、NALCNの開口に関わる機構の解明を目指している。サブスタンスPなどのGPCRを介したシグナルによる制御を中心に検討を進める。

研究成果

• [雑誌論文] Anatomical and electrophysiological development of the hypothalamic orexin neurons from embryos to neonates (2017)
  • 著者名/発表者名: Ogawa Y, Kanda T, Vogt K, Yanagisawa M.
  • 雑誌名: J. Comp. Neurol. in press 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A non-peptide orexin type-2 receptor agonist ameliorates narcolepsy-cataplexy symptoms in mouse models (2017)
  • 著者名/発表者名: Irukayama-Tomobe Y, Ogawa Y, Tominaga H, Ishikawa Y, Hosokawa N, Ambai S, Kawabe Y, Uchida S, Nakajima R, Saitoh T, Kanda T, Vogt K, Sakurai T, Nagaｓe H, Yanagisawa M.
  • 雑誌名: PNAS 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Promising techniques to illuminate neuromodulatory control of the cerebral cortex in sleeping and waking states. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kanda T, Ohyama K, Muramoto H, Kitajima N, Sekiya H.
  • 雑誌名: Neurosci. Res. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.neures.2017.04.009
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Activation of ventral tegmental area dopamine neurons produces wakefulness through dopamine D2-like receptors in mice. (2017)
  • 著者名/発表者名: Oishi Y, Suzuki Y, Takahashi K, Yonezawa T, Kanda T, Takata Y, Cherasse Y, Lazarus M.
  • 雑誌名: Brain Struct. Funct. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s00429-017-1365-7
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Triethyleneglycol, an active component of Ashwagandha (Withania somnifera) leaves, is responsible for sleep induction. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kaushik MK, Kaul SC, Wadhwa R, Yanagisawa M, Urade Y.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 12 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0172508
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Design and Synthesis of Potent and Highly Selective Orexin1 Receptor Antagonists with a Morphinan Skeleton and Their Pharmacologies. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nagase H, Yamamoto N, Yata M, Ohrui S, Okada T, Saitoh T, Kutsumura N, Nagumo Y, Irukayama-Tomobe Y, Ishikawa Y, Ogawa Y, Hirayama S, Kuroda D, Watanabe Y,Gouda H, Yanagisawa M.
  • 雑誌名: J Med Chem. 巻: 60 ページ: 1018-1040
  • DOI: 10.1021/acs.jmedchem.6b01418
  • 査読あり
• [雑誌論文] Peripherally administered orexin improves survival of mice with endotoxin shock. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ogawa Y, Irukayama-Tomobe Y, Murakoshi N, Kiyama M, Ishikawa Y, Hosokawa N, Tominaga H, Uchida S, Kimura S, Kanuka M, Morita M, Hamada M, Takahashi S, Hayashi Y, Yanagisawa M.
  • 雑誌名: Elife. 巻: 5 ページ: -
  • DOI: 10.7554/elife.21055
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Forward genetic analysis of sleep in randomly mutagenized mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Funato H, Miyoshi C, Fujiyama T, Kanda T, Sugiyama F, Takahashi S, Sakimura K, Hayashi Y, Liu Q, Kume K, Wakana S, Takahashi JS, Yanagisawa M.
  • 雑誌名: Nature 巻: 539 ページ: 378-383
  • DOI: 10.1038/nature20142 PMID: 27806374
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] QRFP-Deficient Mice Are Hypophagic, Lean, Hypoactive and Exhibit Increased Anxiety-Like Behavior. (2016)
  • 著者名/発表者名: Okamoto K, Yamasaki M, Takao K, Soya S, Iwasaki M, Sasaki K, Magoori K, Sakakibara I, Miyakawa T, Mieda M, Watanabe M, Sakai J, Yanagisawa M, Sakurai T.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 11 ページ: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0164716
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Timed Inhibition of Orexin System by Suvorexant Improved Sleep and Glucose Metabolism in Type 2 Diabetic db/db Mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsuneki H, Kon K, Ito H, Yamazaki M, Takahara S, Toyooka N, Ishii Y, Sasahara M, Wada T, Yanagisawa M, Sakurai T, Sasaoka T.
  • 雑誌名: Endocrinology. 巻: 157 ページ: 4146-4157
  • DOI: 10.1210/en.2016-1404
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of mutations through dominant screening for obesity using C57BL/6 substrains. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hossain MS, Asano F, Fujiyama T, Miyoshi C, Sato M, Ikkyu A, Kanno S, Hotta N, Kakizaki M, Honda T, Kim SJ, Komiya H, Miura I, Suzuki T, Kobayashi K, Kaneda H, Kumar V, Takahashi JS, Wakana S, Funato H, Yanagisawa M.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 6 ページ: -
  • DOI: 10.1038/srep32453
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] High salt induces autocrine actions of ET-1 on innermedullary collecting duct NO production via upregulated ETB receptor expression. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hyndman KA, Dugas C, Arguello AM, Goodchild TT, Buckley KM, Burch M, Yanagisawa M, Pollock JS.
  • 雑誌名: Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 巻: 311 ページ: R263-71
  • DOI: 10.1152/ajpregu.00016.2015
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in Ins1-cre driver mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa Y, Hoshino Y, Ibrahim AE, Kato K, Daitoku Y, Tanimoto Y, Ikeda Y, Takahashi S, Yoshiki A, Yagami K-i, Iseki H, Mizuno S, Sugiyama F.
  • 雑誌名: Exp. Anim. 巻: 65 ページ: 319-327
  • DOI: 10.1538/expanim.16-0016
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heterogeneous fibroblasts underlie age-dependent tertiary lymphoid tissues in the kidney. (2016)
  • 著者名/発表者名: Sato Y, Mii A, Hamazaki Y, Fujita H, Nakata H, Masuda K, Nishiyama S, Shibuya S, Haga H, Ogawa O, Shimizu A, Narumiya S, Kaisho T, Arita M, Yanagisawa M, Miyasaka M, Sharma K, Minato N, Kawamoto H, Yanagita M.
  • 雑誌名: JCI Insight. 巻: 1 ページ: -
  • DOI: 10.1172/jci.insight.87680
  • 査読あり
• [雑誌論文] Aberrant PD-L1 expression via 3’-UTR disruption in multiple cancers. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kataoka K, Shiraishi Y, Takeda Y, Sakata S, Izutsu K, Takaori-Kondo A, Miyazaki Y, Takahashi S, Shibata T, Kawamoto H, Akatsuka Y, Shimoda K, Takeuchi K, Seya T, Miyano S, Ogawa S., et al.
  • 雑誌名: Nature. 巻: 534 ページ: 402-406
  • DOI: 10.1038/nature18294
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hyperlipidemia and hepatitis in liver-specific CREB3L3 knockout mice generated using a one-step CRISPR/Cas9 system. (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa Y, Oikawa F, Ohno H, Yagishita Y, Satoh A, Osaki Y, Takei K, Kikuchi T, Song-iee H, Mizuno S. Matsuzaka T, Iwasaki H, Kobayashi K, Yatoh S, Yahagi N, Suzuki H, Sone H, Takahashi S, Yamada N, Shimano H.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 6 ページ: -
  • DOI: 10.1038/srep27857
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Mesolimbic neuropeptide W coordinates stress responses under novel environments. (2016)
  • 著者名/発表者名: Motoike T, Long JM, Tanaka H, Sinton CM, Skach A, Williams SC, Hammer RE, Sakurai T, Yanagisawa M.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA. 巻: 113 ページ: 6023-6028
  • DOI: 10.1073/pnas.1518658113
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Orexin B induces GABAA receptor-mediated tonic inhibition in the locus coeruleus. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yonezawa T, Fukuoka J, Kizuka M, Miyazaki T, Kanda T, Yanagisawa M
  • 学会等名: The 94th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
  • 発表場所: アクトシティ浜松（静岡県浜松市）
  • 年月日: 2017-03-29 – 2017-03-30
• [学会発表] Identification of molecular correlates of sleep need by phosphoproteomic analysis (2017)
  • 著者名/発表者名: Qinghua Liu
  • 学会等名: Circadian and sleep medicine symposium
  • 発表場所: Dallas, TX, (USA)
  • 年月日: 2017-03-09 – 2017-03-09
  • 招待講演
• [学会発表] Neuronal firing in the cerebral cortex during waking and NREM sleep. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ohyama K, Miyazaki T, Kanda T, Makino T, McHugh T, Yanagisawa M, Greene RW, Vogt K
  • 学会等名: The 5th Annual IIIS Symposium and the 32nd Wako Workshop
  • 発表場所: 東京コンファレンスセンター品川（東京都港区）
  • 年月日: 2016-12-12 – 2016-12-12
  • 国際学会
• [学会発表] Orexin B plays an inhibitory role in noradrenergic neurons in the locus coeruleus. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yonezawa T, Fukuoka J, Kizuka M, Miyazaki T, Kanda T, Yanagisawa M
  • 学会等名: The 5th Annual IIIS Symposium and the 32nd Wako Workshop
  • 発表場所: 東京コンファレンスセンター品川（東京都港区）
  • 年月日: 2016-12-12 – 2016-12-12
  • 国際学会
• [学会発表] 延髄背側部に存在する新規睡眠・覚醒制御ニューロン群 (2016)
  • 著者名/発表者名: 上田壮志、中司大樹、黒川達哉、石川有希子、柿崎美代、シェラス ヨアン、柳沢正史
  • 学会等名: 日本睡眠学会第４１回定期学術集会
  • 発表場所: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • 年月日: 2016-07-07 – 2016-07-08
• [産業財産権] スルホンアミド誘導体またはその薬学的に許容される酸付加塩 (2016)
  • 発明者名: 長瀬博、柳沢正史、斉藤毅、沓村憲樹、入鹿山容子
  • 権利者名: 国立大学法人筑波大学、ボード・オブ・リージェンツ 他
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2016/067405
  • 出願年月日: 2016-06-12
  • 外国
• [産業財産権] モルヒナン誘導体及びその医薬用途 (2016)
  • 発明者名: 長瀬博、山本直司、入鹿山容子、斉藤毅、柳沢正史、南雲康行
  • 権利者名: 国立大学法人筑波大学、東レ株式会社
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2016-155477
  • 出願年月日: 2016-08-08
• [産業財産権] 対象動物の睡眠状態を判定するためのコンピュータプログラムおよび睡眠状態判定装置 (2016)
  • 発明者名: 柳沢正史、佐藤牧人
  • 権利者名: 国立大学法人筑波大学、ボード・オブ・リージェンツ 他
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2016/081946
  • 出願年月日: 2016-10-27
  • 外国
• [産業財産権] モルヒナン誘導体及びその医薬用途 (2016)
  • 発明者名: 長瀬博、山本直司、入鹿山容子、斉藤毅、柳沢正史、南雲康行
  • 権利者名: 国立大学法人筑波大学、東レ株式会
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2016/081995
  • 出願年月日: 2016-10-28
  • 外国