分子イメージングを基軸とする生細胞内分子計測・光操作法の開発

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26220805
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 小澤 岳昌 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (40302806)
• 研究分担者: 芳賀 早苗 北海道大学, 保健科学研究院, 博士研究員 (60706505)
• 研究期間 (年度): 2014-05-30 – 2019-03-31
• キーワード: 生体材料 / 可視化 / 光操作

研究実績の概要

課題１では，細胞内在性テロメアRNAを１分子で可視化するプローブを開発した．RNA結合タンパク質PUMに変位を加え（mPUM），その結合定数がnMオーダーであることを確認した．mPUMに分割したGFPを連結したプローブを作製し，内在性テロメアに特異的に結合することを実証した．さらに全反射蛍光顕微鏡を用いることにより，１分子のテロメアの動態を可視化することに成功した．平行して，ミトコンドリアからのSmac放出を，分割蛍光タンパク質の再構成法により可視化するプローブを開発した．HeLa細胞とゼブラフィッシュ培養細胞を用いて，ＵＶ刺激によりSmacが放出されると，細胞が蛍光性になることを実証した．開発したプローブを発現するゼブラフィッシュのトランスジェニック体を作製中である．
課題２では，細胞内キナーゼ（Akt）の定量的な光制御技術を開発した．Aktの細胞内局在を光制御するために，光感受性タンパク質CRY2およびCIB１を活用した．青色光の照射回数にともない，Akt活性が上昇することを確認した．このAktの活性化を光で定量的に操作するために，Aktの時間的な活性を記述する数理モデルを構築した．Western blotによる実験データに基づき，人工光感受性Aktの活性の時間的な変動を表す数理モデルの構築に成功した．実験結果とシミュレーション結果との比較検討から，Aktの活性化メカニズムにポジティブ・フィードバック活性化機構が関与することを新たに特定した．同様の原理に基づき，神経細胞の軸索伸長方向を制御する技術開発を行った．
課題３では，GPCRの光制御技術を開発した．GPCRとbeta-arrestinとの相互作用を，CRY2とCIB1を利用することにより，外部光によって制御できることを実証した．GPCRの細胞内局在の変化と細胞内シグナル活性を定量的に評価し，beta-arrestinの寄与を特定することに成功した．

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

課題１では，テロメアRNAを可視化するプローブ開発が当初の予定より早期に終了しており，生細胞内テロメアRNA１分子観察に成功した．これまでの常識とは異なるテロメアRNAのダイナミックな動きを観察しており，統計的解析を進めている．テロメアRNAの機能に関する新たな知見が今後期待できる成果である．課題２ではAktの光制御技術が早期に終了し，当初の計画通りの成果を得ることができた．この技術を基盤として，その発展研究を進めている．具体的には，神経細胞の軸索伸長方向を制御するDCC膜リセプターの多量体化を光で制御する技術開発を進めており，神経初代培養細胞を用いて良好な結果を得ている．将来的には，動物個体での神経ネットワークを光で人工的に構築することを目的とした応用を展望して研究を展開している．
課題３では，GPCRを特異的に阻害する化合物の同定に成功している．化合物ベースの光制御技術と合わせて，GPCR―βarresin相互作用を直接光制御する技術開発に着手し，良好な成果が得られている．GPCR阻害剤とは異なる細胞内シグナル活性が得られており，学術的に興味深い結果を蓄積する段階にある．以上より当初の計画以上の進捗が得られている．

今後の研究の推進方策

課題１では，テロメアRNAの１分子観察データを蓄積し，テロメアRNAとそれに関連するタンパク質との多次元情報取得を目的とした研究を行う．テロメアの活性調節機構に重要な知見を得ることを目的とする．また，ミトコンドリア膜上のBak凝集体のBak分子計測技術を確立し，Bak関連タンパク質への応用展開を図る．
課題２では，DCC光制御技術を線虫個体に応用し，動物個体での神経細胞軸索伸長の光制御を実現する．そのために，光制御ツールを発現するトランスジェニック個体の作製を早期に着手し，神経軸索伸長を個体内で実現可能にする．
課題３では，GPCR阻害剤のキャラクタリゼーションをさらに進めるとともに，光制御技術で得られる結果の相違について，定量的なデータ取得ならびに解析を進める．GPCR活性の制御と細胞内シグナル活性との相関を解明することも目的とする．

研究成果

• [国際共同研究] KNAW/Leiden University/Vrije Universiteit Amsterdam(Netherlands)
  • 国名: オランダ
  • 外国機関名: KNAW/Leiden University/Vrije Universiteit Amsterdam
  • 他の機関数: 1
• [国際共同研究] CNRS-University(France)
  • 国名: フランス
  • 外国機関名: CNRS-University
• [国際共同研究] Hannover Medical School/University of Regensburg(Germany)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Hannover Medical School/University of Regensburg
• [国際共同研究] University of California(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of California
• [国際共同研究] EPFL(スイス)
  • 国名: スイス
  • 外国機関名: EPFL
• [雑誌論文] Simultaneous time-lamination imaging of protein association using a split fluorescent timer protein. (2015)
  • 著者名/発表者名: A. Takamura, M. Hattori, H. Yoshimura and T. Ozawa
  • 雑誌名: Anal. Chem. 巻: 87 ページ: 3366-3372
  • DOI: 10.1021/ac504583t
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Structure-bias relationships for fenoterol stereoisomers in six molecular and cellular assays at the β2-adrenoceptor. (2015)
  • 著者名/発表者名: M.T. Reinartz, S. Kalble, T. Littmann, T. Ozawa, S. Dove, V. Kaever, I.W. Wainer, R. Seifert
  • 雑誌名: Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 巻: 388 ページ: 51-65
  • DOI: 10.1007/s00210-014-1054-5
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Multimodal and multiplex spectral imaging of rat cornea ex vivo using a white-light laser source. (2014)
  • 著者名/発表者名: H.Segawa, Y. Kaji, P. Leproux, V. Couderc, T. Ozawa, T. Oshika, and H. Kano
  • 雑誌名: J. Biophotonics 巻: 9999 ページ: 1-9
  • DOI: 10.1002/jbio.201400059
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] p62/SQSTM1 plays a protective role in oxidative injury of steatotic liver in a mouse hepatectomy model. (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Haga, T. Ozawa, Y. Yamada, N. Morita, I. Nagashima, H. Inoue, Y. Inaba, N. Noda, R. Abe, K. Umezawa, M. Ozaki
  • 雑誌名: Antioxid. Redox Signal. 巻: 21 ページ: 2515-2530
  • DOI: 10.1089/ars.2013.5391
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Developing a potentially immunologically-inert tetracycline-regulatable viral vector for gene therapy in the peripheral nerve (2014)
  • 著者名/発表者名: S. Hoyng, S. Gnavi, F. Winter, R. Eggers, T. Ozawa, A. Zaldumbide, R. Hoeben, M. Malessy, and J. Verhaagen
  • 雑誌名: Gene Therapy 巻: 21 ページ: 549-557
  • DOI: 10.1038/gt.2014.22
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Long noncoding RNA NEAT1-dependent SFPQ relocation between nuclear body paraspeckle and promoter mediates IL8 expression in response to immune stimuli. (2014)
  • 著者名/発表者名: K. Imamura, N. Imamachi, G. Akizuki, M. Kumakura, A. Kawaguchi, K. Nagata, A. Kato, Y. Kawaguchi, H. Sato, M. Yoneda, C. Kai, T. Yada, Y. Suzuki, T. Yamada, T. Ozawa, K. Kaneki, T. Inoue, M. Kobayashi, T. Kodama, Y. Wada, K. Sekimizu, N. Akimitsu
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 53 ページ: 393-406
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2014.01.009
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Assay methods for SUMO-SIM interactions in vivo and in vitro using a split-luciferase complementation system. (2014)
  • 著者名/発表者名: M. Hirohama, A.R. Voet, T. Ozawa, H. Saitoh, Y. Nakao, K.Y. Zhang, A. Ito and M. Yoshida
  • 雑誌名: Anal. Biochem. 巻: 448 ページ: 92-94
  • DOI: 10.1016/j.ab.2013.12.009
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Split Luciferase Complementation for Analysis of Intracellular Signaling (2014)
  • 著者名/発表者名: M. Hattori and T. Ozawa
  • 雑誌名: Anal. Sci 巻: 30 ページ: 539-543
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Methods of split-reporter reconstitution for the analysis of biomolecules (2014)
  • 著者名/発表者名: H. Yoshimura and T. Ozawa
  • 雑誌名: Chem. Record 巻: 14 ページ: 492-501
  • DOI: 10.1002/tcr.201402001
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Imaging and analysis of biomolecules in living cells (2015)
  • 著者名/発表者名: T. Ozawa,
  • 学会等名: PITTCON 2015
  • 発表場所: New Orleans (USA)
  • 年月日: 2015-03-10
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Luminescent sensors for single cell analysis (2015)
  • 著者名/発表者名: T. Ozawa
  • 学会等名: International Symposium on Multi-dimensional Fluorescence Live Imaging of Cellular Functions and Molecular Activities
  • 発表場所: 京都国際会館（京都・京都）
  • 年月日: 2015-01-28
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Luminescent sensors for single cell analysis (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Ozawa
  • 学会等名: Biomedical Molecular Imaging 2014
  • 発表場所: Taipei (Taiwan)
  • 年月日: 2014-11-08
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 二分割ルシフェラーゼ再構成法を用いた生理機能解析法 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小澤岳昌
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都国際会館（京都・京都）
  • 年月日: 2014-10-15
  • 招待講演
• [学会発表] Luminescent sensors and optical switches for single cell analysis (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Ozawa,
  • 学会等名: Shino-Japan Workshop on Chemical Biology
  • 発表場所: Beijing (China)
  • 年月日: 2014-10-11
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Luminescent sensors and optical switches for single cell analyses (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Ozawa
  • 学会等名: Swiss-Japan Chemical Biology Symposium 2014
  • 発表場所: Bern (Swiss)
  • 年月日: 2014-10-03
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 生きた細胞内で機能する内在性RNAイメージング法 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小澤岳昌、吉村英哲、山田俊理
  • 学会等名: 分子研研究会（細胞核内反応の分子科学）
  • 発表場所: 岡崎コンファレンスセンター（愛知・岡崎）
  • 年月日: 2014-09-27
  • 招待講演
• [学会発表] Visualising and Manipulating Cell Stimulation (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Ozawa
  • 学会等名: 8th Pituitary Meeting
  • 発表場所: Edinburgh (UK)
  • 年月日: 2014-09-22
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Imaging and Analysis of GPCRs using Protein Complementation Analysis (2014)
  • 著者名/発表者名: T. Ozawa,
  • 学会等名: 7th Summer School Medicinal Chemistry in Regensburg
  • 発表場所: Regensburg (Germany)
  • 年月日: 2014-09-18
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 生細胞内の生理機能を探る光分析技術 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小澤岳昌
  • 学会等名: 第31回東北大学無機・分析化学コロキウム
  • 発表場所: 東北大学（宮城・仙台）
  • 年月日: 2014-05-30
  • 招待講演