| 研究課題/領域番号 |
26221201
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
佐藤 文彦 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (10127087)
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| 研究分担者 |
南 博道 石川県立大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (90433200)
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| 研究期間 (年度) |
2014-05-30 – 2018-03-31
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| キーワード | 植物アルカロイド生合成系 / 生合成系の分子進化 / 代謝工学と代謝再構築 / 有用二次代謝産物生産 / 生理機能評価 |
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| 研究実績の概要 |
植物二次代謝産物のなかで最も多様は構造と強い生理活性を示すアルカロイド、特に、もっとも研究が進んでいるイソキノリンアルカロイド生合成系の分子進化の解明、代謝再構築による植物細胞・微生物発酵生産系の確立と、イソキノリンアルカロイドの線虫・動物培養細胞系を用いた生理機能評価を行い、以下の成果を得た。
1) ケシ科ハナビシソウのドラフトゲノム配列情報を元に、生合成遺伝子をカタログ化し、解析することによりmacarpine生合成と関連する生合成遺伝子を同定した。転写調節ネットワーク解析を行うために、ハナビシソウから転写因子候補EcbHLH1-1,1-2の機能解析を行ない、EcbHLH1-2がサンギナリン生合成を制御していることを明らかにした。ゲノム編集を用いた相同組換え系をオウレンプロトプラスト系において確立した。
2) トコン培養根、ウマノスズクサ培養細胞からの再分化系を確立し、その発現RNAの配列決定を行った。
3) グリセロールからの(S)-レチクリン生産系を一部改変し、より高効率なレチクリン生産系を確立するとともに、ケシのモルフィナンアルカロイド生合成酵素遺伝子を用いて、テバイン、ハイドロコドンを生産する大腸菌培養系を構築した。 レチクリンからのスタイロピン生合成系をPichia酵母において再構築するとともに、共培養系は反応に時間がかかるが反応阻害が起こりにくいことを明らかにした。
4) マウス3T3-L1細胞を用いた脂肪細胞分化系においてIQAの効果を検証し、ベルベリンを上回る抑制効果を示す化合物を新たに見出した。その作用機構を検証した結果、AMPK を介した作用とともに、新奇な作用機構の可能性を示唆する結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ハナビシソウのゲノム（0.5 Gb）のうち90％以上が塩基配列解読されているが、まだ、遺伝子ネットワーク解析するに十分なゲノムの全体構造解析には至っていない。従って、連携研究者の増員による解析をすすめ、次年度におけるネットワーク解析を可能にする予定である。
また、オウレン細胞におけるゲノム編集技術を確立したこと、転写因子の転写活性化機能における翻訳後修飾の機構が解明され、遺伝子ネットワークの解析基盤が充実してきている。
なお、当初の予定にはなかったが、イソキノリンアルカロイドを分解する細菌が新たに単離され、その代謝系が解析できるようになってきた。従って、イソキノリンアルカロイドの代謝系の分子進化を植物界のみならず、微生物界を含めて解明することが可能になりつつある。
一方、微生物によるアルカロイド生産は、アメリカのグループにタッチの差で遅れをとったが、生合成系の再構築は順調に進んでおり、より高い効率での生産を報告する論文発表もしている。次年度以降、より研究を前倒しで進めることにより、この激化する競争を勝ち抜けると期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
I. ゲノム解読によるケシ科アルカロイド生合成系の解明 ケシ科ハナビシソウゲノム遺伝子のドラフト解読により総塩基数0.42Gb配列情報を得たが、この情報を活用するためには、ゲノム構造の解析、遺伝子機能の推定等多くの解析が必要である。ゲノム情報解析に多くの実績をもつ研究協力者の協力を平成27年度から追加してお願いし、鋭意解析中である。また、遺伝子ネットワーク解析においては、ゲノム編集技術の活用、転写因子の翻訳後修飾機構の解明により、網羅的遺伝子ネットワーク解析を再加速する。
II. 次世代シーケンサー(NGS)を用いた比較ゲノム解析による多様なアルカロイド生合成系の解析 トコン培養根、ウマノスズクサ培養細胞から良質のRNAを調製でき、また、生合成遺伝子を含む十分なRNA配列情報を得た。現在、これ以外の植物種についても準備が進行している。なお、複数のベルベリン分解菌のゲノム情報が得られたことから、植物と微生物の代謝酵素（合成と分解）の比較解析を新たに展開している。
III. 微生物異種発現系を用いたアルカロイド生合成系の再構成 これまで困難とされていたモルフィナンアルカロイドの微生物生産が可能になった。今後は、最近同定されたレチクリンをS体からR体へと変換する酵素STORRの大腸菌での効率的発現を検討する。なお、共培養系は、より簡便かつ柔軟な生合成系の再構築に不可欠であり、その最適化についても検討を進めている。
IV.「多様なIQA産生する培養細胞／植物体、あるいは化合物を用いた生理活性評価 マウス3T3-L1細胞を用いたIQAの活性評価の結果、13-methylberberineがマウス細胞で強い活性をもつことが明らかになった。この結果を受け、微生物によるベルベリン分解物を含め、現在、より多くのprotoberberine型アルカロイドの調製を行っている。
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