| 研究課題/領域番号 |
26221310
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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| 研究分担者 |
川根 徹也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (00265208)
宮崎 敏博 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
森石 武史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983)
増山 律子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (60297596)
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| 研究期間 (年度) |
2014-05-30 – 2019-03-31
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| キーワード | Runx2 / 骨芽細胞 / エンハンサー / 軟骨細胞 |
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| 研究実績の概要 |
Runx2は骨形成において中心的な役割を果たす一方、関節軟骨等に対しては破壊的な作用を持ち、変形性関節症の原因分子となる。Runx2遺伝子の発現制御領域を特定するために、BACクローンを用いて、エクソン１上流130 kb、イントロン１，エクソン２を含む約200 kbのゲノムDNAの下流にGFPをつないだコンストラクトを構築、生理的な発現パターンを再現できるトランスジェニックマウスの作製に成功した。この200 kbの領域を６つに分け、それぞれを欠失する6種類のtgマウスを作製し、その１つの領域から、1.3 kbの骨芽細胞特異的エンハンサーを特定した。さらに、軟骨細胞特異的エンハンサーを含む7.2 kbを同定した。この7.2 kbにHsp68 minimal promoterにつないだGFP トランスジェニックマウスでは、軟骨細胞に発現を認め、骨芽細胞には発現を認めなかった。
BACクローンおよびQuick & Easy Conditional Knockout Kit (loxP/Cre)を用いて、骨芽細胞特異的エンハンサー1.3 kbの両側にloxPを挿入し、Runx2 ObEnfl/+ (ObEn: osteoblast-specific enhancer, fl: flox)マウスを作製した。
骨形成作用のある化合物を同定するため、骨芽細胞特異的エンハンサーを４つタンデムに並べたルシフェラーゼベクター（pGL4.23-4x343）を用い、東京大学創薬オープンイノベーションセンターのコアライブラリー9600のハイスループットスクリーニングを行った。１次スクリーニングの結果167（1.74％）化合物で活性を示した。２次スクリーニング、３次スクリーニングを行い３化合物に絞り込んだ。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
7.2 kb軟骨細胞特異的エンハンサーは、相同性の高い３つの領域のみを組み合わせたコンストラクトを用いたトランスジェニックマウスでは、ミニマルプロモーター、P1、P2プロモーターいずれを用いても、軟骨細胞特異的発現が得られなかった。また、1.3 kbプロモーターと組み合わせても軟骨細胞特異的発現は得られなかった。したがって、7.2kb全体が必要であることがわかった。
骨芽細胞特異的エンハンサー1.3 kbのfloxマウスの作製は順調に進んだ。このエンハンサーのコアエレメントである340bpのノックアウトマウスも作製した。
化合物ライブラリーのスクリーニングは順調に進んでおり、活性の高い化合物も得られている。
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| 今後の研究の推進方策 |
7.2kbとその上流にある保存領域を含む9kb領域を欠失させた軟骨細胞特異的エンハンサーノックアウトマウスの作製を行い、この領域の生理的重要性を調べる。
Runx2の上流、イントロン、下流で、これまで解析してきた２領域以外にも、エンハンサー活性を持つ領域がないか、網羅的に調べる。種を超えた塩基配列の相同性、および骨芽細胞・軟骨細胞分化に関わる転写因子結合部位を指標にCas9/CRISPRシステムを使って、順次ノックアウトマウスを作製し、生理的な重要性を指標に検索を進める。
骨芽細胞特異的エンハンサー1.3 kbのfloxマウスは、germline transmissionを得た後、サザンブロット解析により、1.3kbの欠失を確認する。その後、frpマウスと交配し、neoを除く。
化合物ライブラリーのスクリーニングから得られた活性の高い化合物の周辺化合物を調べ、より活性の高い化合物を得る。さらに、本学所有の化合物および他大学から化合物を集め、さらにスクリーニングを進める。
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