| 研究課題/領域番号 |
26221310
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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| 研究分担者 |
川根 徹也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (00265208)
宮崎 敏博 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
森石 武史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983)
増山 律子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (60297596)
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| 研究期間 (年度) |
2014-05-30 – 2019-03-31
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| キーワード | Runx2 / 骨芽細胞 / エンハンサー / 軟骨細胞 |
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| 研究実績の概要 |
Runx2は骨形成において中心的な役割を果たす一方、関節軟骨等に対しては破壊的な作用を持ち、変形性関節症の原因分子となる。Runx2遺伝子の発現制御領域を特定するために、BACクローンを用いて、エクソン１上流130 kb、イントロン１，エクソン２を含む約200 kbのゲノムDNAの下流にGFPをつないだコンストラクトを構築、生理的な発現パターンを再現できるトランスジェニックマウスの作製に成功した。この200 kbの領域を６つに分け、それぞれを欠失する6種類のtgマウスを作製し、その１つの領域から、1.3 kbの骨芽細胞特異的エンハンサーを特定した。さらに、軟骨細胞特異的エンハンサーを含む7.2 kbを同定した。この２つの領域以外にエンハンサー領域がないか調べるために、Runx2遺伝子の上流、イントロン、下流領域で種を超えた相同性が認められる領域を探索した。このうち２領域に関し、その領域を欠失させたノックアウトマウスを新たに作製した。
Runx2 ObEnfl/+ (ObEn: osteoblast-specific enhancer, fl: flox)マウスで、germline transmissionを得た。さらに、サザンブロット解析により、1.3kbの欠失を確認した。その後、frpマウスと交配し、neoを除いた。1.3kbエンハンサーのコアエレメントである340bpのノックアウトマウスもgermline transmissionを得た。
骨形成作用のある化合物を同定するため、骨芽細胞特異的エンハンサーを４つタンデムに並べたルシフェラーゼベクター（pGL4.23-4x343）を用い、本学所有の化合物（１万）および他大学（２万）からあつめた化合物を用い、スクリーニングを行った。これにより、新たに活性の高い３化合物を得た。また、新たに合成した１化合物で高い活性を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで、解析してきた２領域以外にも、エンハンサー活性を持つ領域がないか、網羅的に調べることにした。種を超えた塩基配列の相同性、および骨芽細胞・軟骨細胞分化に関わる転写因子結合配列の有無を指標にCas9/CRISPRシステムを使って、順次ノックアウトマウスを作製し、生理的な重要性を指標に検索を進めている。Cas9/CRISPRシステムでエンハンサー候補領域の欠失を起こさせる頻度も高く得られるようになり、２７年度は２領域のノックアウトマウスを作製した。
骨芽細胞特異的エンハンサー1.3 kbのfloxマウスおよびそのコアエレメントである340bpのノックアウトマウスの作製は順調に進んだ。
化合物ライブラリーのスクリーニングは順調に進んでおり、ルシフェラーゼ活性だけでなく、Runx2 mRNAも上げる化合物も得られている。逆に、その両者を抑制する化合物も得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
Runx2の上流、イントロン、下流で、種を超えた塩基配列の相同性、および骨芽細胞・軟骨細胞分化に関わる転写因子結合配列の有無を指標にCas9/CRISPRシステムを使って、今後も順次候補領域の欠失マウスを作製していく。同時に、野生型マウス由来軟骨細胞のマイクロマス培養、初期培養骨芽細胞、ATDC細胞を用いてH3K4me1, H3K27Ac抗体を用いたChIP sequenceを行い、Runx2遺伝子領域でエンハンサーに特徴的なクロマチン修飾部位を同定する。両者を併用することにより、エンハンサーの同定と生理的意義の解析を同時に進めていく。
骨芽細胞特異的エンハンサー1.3 kbのfloxマウスは、CAG Cre(germline Cre)マウス、1.3 kbエンハンサーCreマウス、Col1a1 Creマウス、Col2a1 Creマウス、Dermo 1 Creマウスと交配していく。
他大学から集めた新たな化合物ライブラリーのスクリーニングをさらに進める。さらに、新たに合成した化合物のスクリーニングも進める。これまで得られた活性の高い化合物の周辺化合物を調べ、より活性の高い化合物を得る。有望な化合物は、マイクロアレイ解析で、その作用機序を調べる。
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