| 研究課題/領域番号 |
26241014
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
中田 慎一郎 大阪大学, 医学系研究科, 特命教授 (70548528)
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| 研究分担者 |
逆井 良 金沢医科大学, 医学部, 助教 (10549950)
寺尾 由里 大阪大学, 医学部, 技術職員 (80466846)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | DNA修復 / ユビキチン / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
Ｃａｓ９を用いて標的遺伝子にＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）をいれ、細胞外から導入したＤＮＡ修復鋳型を用いたＤＮＡ修復を誘導することで、ゲノム編集を行うことが可能である。しかし、ＤＳＢの修復では、ヌクレオチド欠失や挿入（ｉｎｄｅｌ）を伴う非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復が優位に起こるため、意図通りのゲノム編集を行うことが難しい。本研究では、Ｃａｓ９の変異体Ｄ１０Ａを用いて、標的遺伝子の１つのＤＮＡ鎖に2カ所のニックを入れるタンデムニック法および標的遺伝子とドナープラスミドのそれぞれに１カ所ずつのニックを入れるＳＮＧＤ法により、ｉｎｄｅｌ発生が強く抑制され、かつ効率の良いゲノム編集が可能であることを示した。これらの方法によるゲノム編集では、長いＤＮＡ長のドナーを用いることが有利であることも示した。鋳型配列上にサイレント変異を導入したドナーを用いてＳＮＧＤ法によるゲノム編集を行った場合、野生型の配列を持つドナーを用いたゲノム編集と比べ、効率が著しく低下した。これにより、ＳＮＧＤ法で相同組換え様の修復機構を用いていることが示された。
その他、ＤＳＢ修復経路選択に関わるＢＲＣＡ１および５３ＢＰ１の相互作用および両者を欠損する細胞における、修復機構の解析（ＲＡＤ５１のＤＮＡ損傷部位への局在機構など）を行った。さらに、ＲＮＦ１６８のＤＳＢ部位への局在機構について、結晶構造解析結果を基に細胞内での分子機構の一部を明らかにした。また、共同研究により、ＤＮＡ架橋修復におけるユビキチンの関与を解明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
DNA2本鎖損傷における修復機構として、５３ＢＰ１をＤＮＡ損傷部位にリクルートする因子であるＲＮＦ１６８がＤＳＢ部位に局在する分子機構の解明に迫るだけの分子生物学的根拠を得たこと、ＢＲＣＡ１および５３ＢＰ１両者を欠損する細胞における修復機構が明らかになってきたこと、共同研究で５３ＢＰ１・ＲＩＦ１とＢＲＣＡ１のＤＮＡ損傷部位への時空間的変化が重要であることを示し、また、新たなＥ３ユビキチンリガーゼがＤＮＡ架橋修復を制御すること、そして、高効率かつ正確なゲノム編集法の開発に成功し、目標十分に達成したと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ＳＮＧＤ法によるゲノム編集法の分子機構の解明に挑むとともに、これまでレポーター遺伝子を用いて評価していたものを、エンドの遺伝子の編集により評価する。また、ノックアウト細胞を用いたＤＳＢ応答について、これまで使用していないＤＮＡ障害性薬剤への感受性評価や、ＤＮＡ損傷因子のＤＳＢ部位への局在機構を解明し、研究を完成させる。
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