DNA二本鎖損傷修復経路選択機構の解明とゲノム編集技術への応用

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26241014
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 中田 慎一郎 大阪大学, 医学系研究科, 特命教授 (70548528)
• 研究分担者: 逆井 良 金沢医科大学, 医学部, 講師 (10549950)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: DNA損傷応答 / DNA修復 / 相同組み換え / PARP阻害剤 / ゲノム編集

研究実績の概要

① RNF8経路は、DNA2本鎖切断（DSB）修復において相同末端結合（NHEJ）促進に機能する分子53BP1をDNA損傷部位にリクルートするために不可欠な分子である。また、HRを促進するBRCA1が過剰に機能することを抑制している。これらの知見は、RNF8経路がNHEJ促進に機能することを示している。しかし、RNF8経路がBRCA1以下のHR機構に関与するかについては未知であった。RNF8によるHR制御の分子機構を解析するため、BRCA1/53BP1/RNF8のノックアウト細胞株を用い、研究を行った。PARP阻害剤によるDNA損傷を発生させたときのRAD51のDNA損傷への集積をリードアウトとした解析により、RNF8はBRCA1存在下ではRAD51リクルートに重要ではないものの、BRCA1陰性細胞ではRNAD51リクルートを促進することが示された。また、RNF8はBRCA1/53BP1ダブルノックアウト細胞のPARP1阻害剤抵抗性の原因となっていることも示された。このことから、RNF8経路はBRCA1非存在時のHRの促進因子として機能することが示された。
② 新規に開発中のDSBを用いないゲノム編集法において、ゲノムがドナーDNAを取り込む過程を検証した。その結果、編集対象としたヌクレオチドから数百塩基にわたる領域において、ドナープラスミドに設計した修復鋳型がゲノムに取り込まれることが示された。さらに、このゲノム編集法を発展させ、DSBおよびドナーDNAを用いないゲノム編集法の開発に取り組み、効率は高くないものの、ゲノム編集が可能であることを示した。今後、この手法の改良に取り組み、従来法よりも安全性を飛躍的に高めたゲノム編集法を確立する。

現在までの達成度 (段落)

平成29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] University of Nebraska Medical Center(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of Nebraska Medical Center
• [雑誌論文] Precise and Efficient Nucleotide Substitution near Genomic Nick via Non-Canonical Homology-Directed Repair (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakajima K, Zhou Y,Tomita A,Hirade Y, Gurumurthy CB, Nakada S
  • 雑誌名: Genome Research 巻: 28 ページ: 223-230
  • DOI: 10.1101/gr.226027.117.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural insights into two distinct binding modules for Lys63-linked polyubiquitin chains in RNF168 (2018)
  • 著者名/発表者名: Takahashi TS, Hirade Y, Toma A, Sato Y, Yamagata A, Goto-Ito S, Tomita A, Nakada S, Fukai S
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 9 ページ: 170
  • DOI: 10.1038/s41467-017-02345-y.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel polyubiquitin imaging system, PolyUb-FC, reveals that K33-linked polyubiquitin is recruited by SQSTM1/p62. (2018)
  • 著者名/発表者名: Nibe Y, Oshima S, Kobayashi M, Maeyashiki C, Matsuzawa Y, Otsubo K, Matsuda H, Aonuma E, Nemoto Y, Nagaishi T, Okamoto R, Tsuchiya K, Nakamura T, Nakada S, Watanabe M.
  • 雑誌名: Autophagy 巻: 14 ページ: 347-358
  • DOI: 10.1080/15548627.2017.1407889.
  • 査読あり
• [雑誌論文] T315I mutation of BCR-ABL1 into human Philadelphia chromosome-positive leukemia cell lines by homologous recombination using the CRISPR/Cas9 system. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tamai M, Inukai T, Kojika S, Abe M, Kagami K, Harama D, Shinohara T, Watanabe A, Oshiro H, Akahane K, Goi K, Sugihara E, Nakada S, Sugita K.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 ページ: 9966
  • DOI: 10.1038/s41598-018-27767-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Human Rad52 Promotes XPG-Mediated R-loop Processing to Initiate Transcription-Associated Homologous Recombination Repair. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yasuhara T, Kato R, Hagiwara Y, Shiotani B, Yamauchi M, Nakada S, Shibata A, Miyagawa K.
  • 雑誌名: Cell 巻: 175 ページ: 558-570
  • DOI: 10.1016/j.cell.2018.08.056
  • 査読あり
• [雑誌論文] BRCA1 ensures genome integrity by eliminating estrogen-induced pathological topoisomerase II-DNA complexes. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sasanuma H, Tsuda M, Morimoto S, Saha LK, Rahman MM, Kiyooka Y, Fujiike H, Cherniack AD, Itou J, Callen Moreu E, Toi M, Nakada S, Tanaka H, Tsutsui K, Yamada S, Nussenzweig A, Takeda S.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA. 巻: 115 ページ: E10642-E10651
  • DOI: 10.1073/pnas.1803177115
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The E3 ligase RFWD3 promotes timely removal of both RPA and RAD51 from DNA damage sites to facilitate homologous recombination. (2017)
  • 著者名/発表者名: Inano S, Sato K, Katsuki Y, Kobayashi W, Tanaka H, Nakajima K, Nakada S, Miyoshi H, Knies K, Takaori-Kondo A, Schindler D, Ishiai M, Kurumizaka H, Takata M
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 66 ページ: 622-634
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2017.04.022.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Aquarius is required for proper CtIP expression and homologous recombination repair. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sakasai R, Isono M, Wakasugi M, Hashimoto M, Sunatani Y, Matsui T, Shibata A, Matsunaga T, Iwabuchi K.
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 7 ページ: 13808
  • DOI: doi.org/10.1038/s41598-017-13695-4
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] DNA2本鎖切断を作らず、ニックでゲノム編集を誘導する (2018)
  • 著者名/発表者名: 中田慎一郎
  • 学会等名: ゲノム編集学会
  • 招待講演
• [学会発表] ニックにより誘導するIndel発生が少ないゲノム編集 (2018)
  • 著者名/発表者名: 中田慎一郎
  • 学会等名: 日本核酸医薬学会生物セッション第2回サテライトシンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] ニックを用いた正確なゲノム編集法 （SNGD法） (2018)
  • 著者名/発表者名: 中田慎一郎
  • 学会等名: 日本遺伝子細胞治療学会
  • 招待講演
• [学会発表] Precise gene editing by a combination of single nicks in the target gene and donor plasmid. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shinichiro Nakada, Kazuhiro Nakajima, Yue Zhou, Akiko Tomita, Yoshihiro Hirade.
  • 学会等名: Gordon Research Conference
  • 国際学会
• [学会発表] ニックによる正確で効率のよいゲノム編集法では 非古典的なHDRが利用されている (2017)
  • 著者名/発表者名: 中田慎一郎
  • 学会等名: ゲノム編集学会
• [学会発表] Repair pathways for one-ended DNA double-strand breaks caused by camptothecin. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sakasai R, Sunatani Y, Matsui T, Iwabuchi K.
  • 学会等名: Gordon Research Conference
  • 国際学会
• [備考] 大阪大学 高等共創研究院・大学院医学系研究科 細胞応答制御学
  • URL: http://www.bcr.med.osaka-u.ac.jp
• [備考] 遺伝子変異が発生しにくい新しいゲノム編集法を開発 ～安全な遺伝子治療に向けた新技術～
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/activities/results/2018year/nakada0202
• [備考] DNA２本鎖が切断された場所に修復タンパク質が集まる仕組み
  • URL: http://www.med.osaka-u.ac.jp/activities/results/2018year/18-01-12
• [産業財産権] ゲノム編集された細胞を製造する方法 (2018)
  • 発明者名: 中田慎一郎
  • 権利者名: 国立大学法人大阪大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2018-215588