| 研究課題/領域番号 |
26249127
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
中村 史 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 研究グループ長 (40357661)
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| 研究分担者 |
加藤 義雄 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (20415657)
小林 健 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 集積マイクロシステム研究センター, 研究チーム長 (20415681)
池袋 一典 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70251494)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / ナノニードル / アプタマー / オフターゲット効果 / 細胞操作 / 制御放出 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、人工ヌクレアーゼを用いて目的遺伝子以外の部分に損傷を与えない安全で確実、高効率なゲノム編集技術を開発することを目的としている。平成27年度、ZFタンパク質の導入においてATPアプタマーを利用した制御放出を検討し、細胞内にZFタンパク質の導入が可能であることを確認した。これと並行して、FokIアプタマーの探索およびCas9アプタマーの探索を行い、また、ナノニードルアレイを高周波振動することで、細胞内で特異的にgRNAとCas9タンパク質の複合体を放出させる方法を検討し、32%の効率でGFP遺伝子破壊が可能であることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
加振による物質放出法により、CRISPR/Casシステムの導入を行い、32%のゲノム編集（GFP遺伝子破壊）効率を達成した。細胞にナノニードルアレイを挿入した後に、高周波振動を行うことで、細胞内で特異的な人工ヌクレアーゼの制御放出を行うことに成功したと言える。また、ATPアプタマーを用いた制御放出において、細胞内でZFタンパク質の放出量が増大することを確認した。今後は、ZFヌクレアーゼを導入し、ゲノム編集が可能であるかどうかを検証する。
人工ヌクレアーゼの作製において、GFP融合Cas9タンパク質を新規に作製した。これを用いることによってナノニードル表面上から放出されるgRNA-Cas9複合体の定量的な解析が可能となった。
また、人工ヌクレアーゼを結合するアプタマーとして、FokIアプタマーで７種、Cas9アプタマーで２種の配列の取得に成功している。ATPアプタマーと放出性能を比較しながら、これらアプタマーの利用も併せて検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は、非相同末端結合による遺伝子修復を回避するために2種のgRNAを同時に導入する手法を開発し、オフターゲット効果と、遺伝子破壊効率の関係を調査する。また、アプタマーを用いた制御放出系によって、ZFNタンパク質を導入することで、ヒトリンパ球細胞等のヒト由来細胞に対してCCR5遺伝子の破壊を試み、オフターゲット効果の発生を評価する。
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