研究課題
哺乳類の雌ではXY である雄との遺伝子量補正のため、2 本のX 染色体のうち一方が不活性化される。これまで、ES 細胞の分化系などを使い、不活性化の分子機構解明の研究が精力的に行われてきたが、個体において実際に不活性化がいつ、どのようにして成立するのか、不活性化の組織・器官特異性や安定性、不活性化現象が生物個体の機能やヒト女性特有の病態にどのように影響するかについての研究は非常に少ない。本研究では、申請者が独自に開発した、Ｘ染色体不活性化を可視化するXvis マウス系統を用いて、1）不活性化・再活性化過程のイメージング解析、2）胎児期、成体の各臓器における不活性化偏在パターン（遺伝モザイシズム）のマッピング、3）女性特有のX 連鎖遺伝病態モデルマウスの作製と解析などを通じて、X 染色体不活性化現象の生体機能への関わりを包括的に解析することを目的とする。2014年度は、着床前後のXvisマウス胚のイメージング解析を行い、蛍光蛋白質の発現から、刷り込み型Ｘ染色体不活性化の消去とランダム型不活性化の成立のタイミングを決定した。同時に、不活性化の指標であるXist RNAの発現・局在を調べたところ、Xvisマウス胚の解析結果とほぼ一致することが確認され、Xvisマウスが不活性化過程のモニターに有用であることが示された。また、3D-ISM（3次元内部顕微鏡）を用いて、心臓、脳などの臓器の不活性化偏在パターンの画像データを取得した。さらに、CRISPR/Cas9技術を用いて、Rett症候群のモデルマウス作製するためのコンストラクト作製を行った。
2: おおむね順調に進展している
研究全体は、概ね計画どおりに順調に進展している。すでに、複数の胚発生ステージにおいて、Xvisマウス胚の画像取得を終了しており、成体臓器についても脳や心臓、腎臓などの臓器の3次元断面像を3次元内部顕微鏡を用いて取得済みである。研究計画では、Xvisマウスの一方のＸ染色体に遺伝子変異を導入し、Ｘ連鎖遺伝病のモデル系統を作製し、その病態とＸ染色体不活性化パターン（遺伝モザイシズム）との関連を追究することを目的としている。2014年度中にその病因遺伝子の選択を行い、その遺伝子にCRISPR/Cas9技術を用いて変異を導入するための複数のガイドRNAコンストラクトの作製を行った。このガイドRNAコンストラクトを、培養細胞に導入し、実際に効率良く変異導入が起きることを確認した。
達成度の項に記したように、研究全体は計画に沿って進展しており、深刻な問題点も無いので、研究計画は大幅に変更することなく、2015年度も実施していく。3次元内部顕微鏡による臓器内部の観察は、他の方法では得ることの出来ない貴重な情報を得ることができる優れた方法であるが、取得される画像データサイズが膨大なものとなり、そのデータ取得、画像処理には多大な時間とコストが必要となる。したがって、すべての臓器の解析ではなく、複数個体について、それぞれ2~3種の臓器に焦点を置き解析することにより、不活性化偏在パターンの個体差について定量的なデータを得ることを目指す。Xvisマウス胚を用いて、着床前後におけるＸ染色体不活性化ダイナミクスを明らかにすることができたので、今後は不活性化変動過程の分子レベルの変化をXvisマウス胚を用いて解析していく。Ｘ連鎖遺伝病モデルに関しては、Rett症候群以外のモデル作製についても検討する。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (8件) (うち国際共著 1件、 査読あり 8件、 謝辞記載あり 7件、 オープンアクセス 5件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 1件) 図書 (3件)
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