| 研究課題/領域番号 |
26251006
|
|---|
| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
|---|
研究代表者 |
箱嶋 敏雄 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (00164773)
|
|---|
| 研究分担者 |
稲垣 直之 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (20223216)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | 構造生物学 / 生化学 / 細胞生物学 / 分子生物学 / 生物物理学 / タンパク質 / 相互作用 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本年度は、shootin1、cortactin、L1、KIF20Bの組み換えタンパク質の大量調製と相互作用解析による相互作用ドメインのマッピングと、それらドメインの組み換えタンパク質の大量調製を完成して結晶化を始めた（箱嶋グループ）。また、相互作用領域のin vivoでの機能・重要性を細胞レベルで解析するための準備も開始した（稲垣グループ）。本丸であるshootin1は、種々の発現系の検討の結果、全長タンパク質を精製できる系を効率化するとともに、この系で精製した全長タンパク質を用いて、ドメインマッピングや相互作用解析を進めた。その結果、野生型の全長タンパク質は「OFF」状態であり、L1やcortactinへの結合親和性が弱く、構造的には「閉じた」状態にあることが考えられた（作業仮説１）。一方、cortactinやL1への強い結合活性をもつ「ON」状態のshootin1は、２か所のリン酸化部位（ヒトではSer101とSer249）をGluに置換した疑似リン酸化型の全長タンパク質で調製可能であり、この活性型のshootin1を用いたドメインのマッピングも進めた。その結果、ドメイン分割した多くのタンパク質試料は沈殿や分解を起こすことが判明したので、研究期間を延長（繰り越し）して、実験を続けた。種々のコンストラクトを試した結果、N-末端側の複数のコンストラクトでタンパク質試料に調整が可能となった。一方、C-末端側には，アミノ酸配列からの予測通り、天然変性状態の領域が続いており，安定なドメイン（あるいは領域）の同定には至らなかった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の対象となっているshootin1やcortactinの組み換えタンパク質の調製は、当初予想していたよりもはるかに困難なものであることが判明した。従って、当初計画に比べた全体としての研究の達成度は不十分なものとなっている。一方で、N-末端ドメイン等の困難なタンパク質試料調製を克服して、一定の試料が得られるようになったことは、今後の解析に希望がでてきた。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度に調製可能となったshootin1のN-末端ドメインについて、タンパク質物性や相互作用解析を進めていく（箱嶋グループ）。また、shootin１等の輸送に関する解析も引き続き進める（稲垣グループ）。
|
