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今年度は、昨年に引き続き、ヒストンシャペロンCIA1/Asf1やATP依存的クロマチンリモデリング因子Acf1がNickヌクレオソームに対して親和性があるのか否か、について調べた。期待に反して、ゲルシフトアッセイなどの生化学的解析から強い親和性を示さず、安定で均一な複合体を形成するデータはえられなかった。結果として、安定で均一な複合体を形成する証拠は、昨年度取得に成功したFACT機能ドメイン (Mid-AID) と二本鎖DNA切断 (DSB) ヌクレオソームの複合体のみであった。従って、その複合体の結晶構造解析を目指した。様々な条件下で結晶化スクリーニングを試みた。幾つかの条件で結晶を得ることができたが、結晶の成分をSDS-PAGEで解析したところ、ヌクレオソームの単独結晶である事が判明した。それ故、以降の解析を断念した。次に複合体の電子顕微鏡観察を行った。最初に負染色を用いて確認したところ、粒子のそろった複合体が観察された。そこで、複合体構造の分解能をあげるために、試料を凍結し、クライオ電子顕微鏡で観察を行った。試料の凍結条件については塩濃度や氷の厚さなどのパラメータを変えて検討し、最適な観察条件を見つける事ができた。これらの観察結果を基に電子顕微鏡単粒子解析を行っているが、現在まだ解析中である。今後、電子顕微鏡単粒子解析を行って得られた電子密度マップに、各ドメインのX線構造原子モデルを当てはめることで、複合体の詳細な立体構造モデルを構築することが可能となる。複合体の立体構造モデルが決定すれば、論文として発表する予定である。
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