| 研究課題/領域番号 |
26252015
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
小鹿 一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (50152492)
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| 研究分担者 |
矢島 新 東京農業大学, 応用生物科学部, 准教授 (30328546)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 疫病菌 / Phytophthora / 交配ホルモン / 受容体 / 生合成 |
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| 研究実績の概要 |
１．疫病菌交配ホルモン受容体の探索
前年度までに３種のα1蛍光プローブ、アフィニティー精製用ビーズ、光親和性プローブを合成して受容体の探索を試みたが、α1受容体をもつA2交配型特異的なタンパク質を検出できなかった。この要因として受容体タンパク質の発現量の低さが考えられたので、戦略を転写レベルでの発現解析に変更した。これまでに、保有する約70株の疫病菌の対峙培養試験の結果からホルモン感受性・非感受性株を６種類選定し、大量培養、RNA抽出・精製を進めている。一方、α1のホルモン活性がα2により阻害される、すなわちα2はα1のアンタゴニストである、ことを偶然発見し、α2もα1と同等の強さでα1受容体に認識されるというモデルを提唱した。このことはα2プローブを用いてα1受容体を探索できることを示唆する。
２．交配ホルモン生合成酵素の特定
前年度までに、α2生合成酵素をもつと考えられるA2交配型からタンパク質を粗抽出し、phytolからα2の生成を高感度LC/MSにより解析したが、成功しなかった。そこで、菌株を精査した結果、phytolを直接α1まで高効率で変換する株が見つかった。そこで、この株から粗タンパク質を抽出してこの変換をin vitroで確認したが、α1の生成は検出できなかったものの、粗タンパク液にα2を添加すると極微量ではあるがα1の生成を確認できた。ただ、その活性は菌体そのものを用いた時の数%しかないため酵素の精製には至っていない。また、菌体を純水や緩衝液中でphytolとインキュベートするだけで高率でα2を生成するのに対し、菌体をわずか数回すりつぶ程度のホモジナイズで失活したことから、生化学的解析は断念することとした。現在は受容体探索と同様に転写レベルでの発現解析を進めるべく菌株の選定作業を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
交配ホルモン受容体に関しては、α1受容体の同定を目的にα1蛍光プローブ、アフィニティー精製プローブ、光親和性プローブを合成し、菌体抽出タンパク質中の受容体の検出を前年度同様試みてきたが、いずれの実験でも残念ながら受容体の存在自体を確認できておらず、達成度は満足のいくものではない。こうような結果を受けて、下記のように今後の戦略の練り直しを行い、準備を開始している状況である。
生合成酵素の探索では、菌体抽出粗タンパクにα2合成活性は見出しておらず、菌体を少しでもすりつぶすと酵素活性が失活することが判明したので、達成度は満足のいくものではない。また、菌株を変更することで僅かではあるがα2からα1への変換、すなわちα1生合成酵素活性をin vitroで確認できたものの、この低い変換効率では酵素精製の見込みは低いと判断しており、このような結果を受けて下記のような方策で引き続き生合成酵素探索を継続する。
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| 今後の研究の推進方策 |
交配ホルモン受容体に関しては、２つの戦略で進める予定である。１つは、引き続き生化学的アプローチを進める。すなわち、受容体探索プローブのサイズが天然ホルモンの２倍以上あるために受容体に認識されないという可能性から、αホルモンの放射性同位体ラベルを行う。なおα1は化学的に不安定でラベル化が難しいのでα2をラベル化する。これを用いてA2交配型からα2受容体を探索する。また上記のように、α2はα1のアンタゴニストであることを発見しているのでA1交配型を使ってα1受容体も探索できる可能性がある。一方、分子生物学的アプローチ、すなわち遺伝子発現解析により受容体遺伝子の候補を探索する試みも進める。現在、既に適切な菌株を数種選定して培養、RNA抽出を進めている。
生合成酵素の探索では、α1合成酵素の活性の検出に成功したが極めて活性が低いこと、α2合成酵素の活性は検出できなかったことから、受容体探索と同様に、遺伝子発現解析により候補遺伝子を探索する計画である。現在、ホルモンを高レベルで生産する株と全く生産しない株の選定を行い、RNA抽出に向けて準備を進めている。
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