| 研究課題/領域番号 |
26252058
|
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
橋床 泰之 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40281795)
|
|---|
| 研究分担者 |
村井 勇太 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 助教 (20707038)
内田 義崇 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (70705251)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
|
| キーワード | 無機窒素代謝 / 遺伝子水平伝播 / 亜酸化窒素放出 / Pseudomonas属 / Burkholderia属 / 土壌細菌 / 環境負荷 / 酸性環境 |
|---|
| 研究実績の概要 |
N2O放出能の高い北海道黒ボク畑地土壌，熱帯泥炭開墾土壌，ならびに亜北極湿地ミズゴケから亜酸化窒素（N2O）生成細菌を探索･分離し，それらのN2O生成鍵遺伝子の解析を試みた。黒ボク土壌から分離したN2O生成能の極めて高い10株について，16S rRNA遺伝子の相同性による同定を試み，これらが全てPseudomonas属細菌であることを明らかにした。また，これら分離株のショ糖添加によるN2O亢進効果とN2O生成の基質受容性の検討により，これらが脱窒過程の最終ステップを行わず，N2Oを最終電子受容体として放出することを明らかにした。分離株10株は，N2O還元酵素を特異的に阻害するアセチレン阻害試験によって，明らかにN2O還元酵素活性を喪失しN2O放出レベルが有意に上昇しない株群（6株）と，アセチレン添加でN2O放出量の2倍程度の増加が再現性良く認められる株群（4株）に分けられた。これら2群全株に対し，２種類のプライマーペアによるN2O還元酵素遺伝子（nosZ）の検出を試みた結果，前者の株群は６株全てでnosZが検出されず，後者は全てnosZが検出された。全株で検出された硝酸還元酵素遺伝子（narG）は，16S rRNA遺伝子1.5 kbpを用いた系統樹解析と高い類似性を示したが，nosZではその関係性が崩れており，nosZでは欠落や属間水平伝播が起こりやすいと考えられた。また，熱帯泥炭地から得られる強力なN2O放出Burkholderia属細菌がGammaproteobacteria亜門に由来する脱窒関連遺伝子を持つことから，難培養性Gammaproteobacteria亜門細菌の検索のため，熱帯泥炭土壌からDGGE解析に耐えうる高品質DNAの調製法を確立した。深さ4 m熱帯泥炭土壌にGammaproteobacteriaであるEscherichia coli近縁の難培養微生物が高密度に棲息している証拠を得た。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
N2O放出能の高い亜北極湿地のミズゴケ葉表面から亜酸化窒素（N2O）生成細菌を探索し，地上性のSphagnum capillifolium （ムラサキミズゴケ）から極めて活性の高いPseudomonas属細菌を分離することに成功した。この分離株は，これまでSphagnum fuscum（チャミズゴケ）表面から分離したBurkholderia属細菌よりも100倍量のスケールでN2O放出活性を示し，ショ糖添加時には北海道の黒ボク土壌から分離したPseudomonas属細菌よりも10倍強力な活性を示し，その放出能は熱帯泥炭開墾地のBurkholderia属N2O放出細菌と同等である。本菌株はN2O生成に関する特徴的な挙動や応答から，次世代シーケンサーによる全ゲノムDNA解析の対象菌株としての意味が大きい。すなわち，脱窒に関わる機能性遺伝子の水平伝播が亜北極ホットスポットでも起こっているかという，PCR法では完全に証明することが出来ない命題に対し，最終的な結論を与えるための検証になり得る。亜北極のホットスポットから強力なN2O放出研究対象菌株が得られたことから，北海道黒ボク畑地土壌，熱帯泥炭開墾土壌，ならび亜北極泥炭湿地のそれぞれから強力な脱窒型N2O放出細菌がそろったことになる。従って，これらの株が保有する脱窒関連遺伝子群についてそれぞれ次世代シーケンサーでの解析を行い，水平伝播により獲得された外来の機能性遺伝子が環境微生物に対するN2O放出能の付与にどれほど寄与しているかを明らかにするための準備が整った。初年度としての目的は，概ね達成された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
Sphagnum capillifolium （ムラサキミズゴケ）から分離した高活性Pseudomonas属細菌の，次世代シーケンサーによる全ゲノムDNA解析を行い，脱窒に関わる遺伝子の置き換わりや取り込みが起こっているか否かを検証する。また，GFP遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて，北海道黒ボク畑地土壌，熱帯泥炭開墾土壌，ならび亜北極泥炭湿地それぞれのN2O放出ホットスポットから分離した菌株の棲息環境（酸性土壌，腐植酸高含有，トウモロコシ根残渣や凍結後融解など）を再現し，これら環境圧によって遺伝子水平伝播の頻度が増すか否かを検定する。特に，熱帯泥炭地から得られる強力なN2O放出Burkholderia属細菌がGammaproteobacteriaに由来する脱窒関連遺伝子を持つことが既に明らかになっていることから，その遺伝子ドナーあるいはそのドナーに極めて近縁の脱窒関連遺伝子をもつGammaproteobacteria亜門細菌の分離検索を試みる。また，N2O生成ステップのみならず，幾つかの特徴的な地点で採取した微生物群集について，窒素循環に関わる遺伝子群の水平伝播に関してその分布や頻度を調査する。N2O生成，あるいは亜硝酸からNOの生成を抑制する化合物の検索を試み，その一環として今年度はNOを遊離する反応を触媒するnitrite reductase （亜硝酸還元酵素）阻害をチトクローム型酸化還元酵素阻害剤として開発された農業用抗菌剤等の中に広く検索してゆく予定である。
|
| 備考 |
北海道大学農学部応用生命科学科生態化学生物学研究室のスタッフ「橋床 泰之」からリンクでのみ閲覧可。これまでの研究を網羅した研究テーマ解説と業績，本科研費を含めた外部資金リストなどがデータとしてアップされている。
|
