研究課題/領域番号 |
26253069
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研究機関 | 京都大学 |
研究代表者 |
川口 義弥 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (60359792)
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研究分担者 |
山田 泰広 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (70313872)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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キーワード | 発生学 |
研究実績の概要 |
1) レポーターES細胞作製とRainbow Mouse, Rainbow Organoidの作製と解析:計画通り、昨年度までに作製したダブルレポーターES細胞を用いてin vitro分化誘導を行った。Rainbow Organoidの免疫染色、同じレポーターES細胞を用いて作製したRainbow Mouseの解析でシステムが確実に働いている事を確認した。次に、in vitro組織誘導プロトコールでの(分化前)内胚葉上皮細胞と(分化後)食道・胃細胞をFACS採取し、発現遺伝子解析から食道・胃への分化制御機構の解明を目指した。ところが、誘導された内胚葉上皮細胞、さらには元々のES細胞までもが均一な細胞集団ではない事が判明した。そこで、新たにSox2遺伝子座にBFPをノックインしてSox2/P63/GATA4のトリプルレポーターES細胞を樹立し、epiblast, 中内胚葉細胞を経てSox2-/GATA4 highの内胚葉細胞をFACSでpureな細胞集団として採取する事が可能となった。 2) 食道―胃接合部形成/維持におけるNotchシグナルの意義解明:Notchシグナルの関与を想定し、in vitro分化誘導系でDAPT添加によるloss of function実験を行ったが、食道―胃接合部形成に明らかな変化は認めなかった。計画通り、in vivoでの検証として交配にてSox2-CreER;NICDfloxedマウスによるgain of function実験、Sox2-CreER;Hes1floxedマウスによるloss of function実験を行うべくそれぞれのマウスの作製を終えた。 3)試験管内胃がんモデルの作製:計画書通りSox2-CreER;Apcfloxedマウスの作製を終え、同マウスからのES細胞樹立に成功した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究項目1)以外は概ね計画通りに研究が進行している。研究項目1)の遅れの理由は、作製済みであった原腸オルガノイドが、予想に反して不均一な細胞集団から構成されていると判明したことにある。それに加えて、分化誘導に使用するES細胞自身が不均一であることも分かった。そこで、初期発生現象そのものに着目する必要性を感じ、Sox2レポーターも加えたトリプルレポーターES細胞を新たに樹立することで以下の事が分かった:これまでの報告ではマウスES細胞はSox2陽性であるが、GATA4が陽性であるか陰性であるかがはっきりしていなかった。我々が作製したトリプルレポーターES細胞は、通常の培養維持条件ではGATA4陽性集団(のちに原始内胚葉を経て卵黄嚢になるもの)とGATA4陰性集団(epiblastを経て胚(体細胞)になるもの)に分かれることが分かった。そこで、2iLIFでSox2+/GATA4-のみのground stateの状態(inner cell massの状態)にしたうえでepiblast、中内胚葉を経て内胚葉細胞に誘導可能である。 初期発生に着目し、新たなES細胞(トリプルレポーターES細胞)を樹立したことで、計画の遅れを生じる事となったが、上記重要な知見を得る事が出来た。
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今後の研究の推進方策 |
1)トリプルレポーターES細胞によるRainbow Mouse, Rainbow Organoidを用いた食道/胃分化制御機構の解明:作製済みの均一な内胚葉細胞を用いてRainbow Organoidを作製し、分化誘導前後の細胞のFACS分取とマイクロアレー解析及びエピゲノム解析で、食道/胃への分化制御機構を解明する。同時に、同じES細胞を用いて作製したRainbow Mouseでの分化制御と照らし合わせる。内胚葉上皮完成と食道・胃上皮細胞形成の間の3日間の現象の全容を把握する事を目指す。 2)食道―胃接合部形成/維持におけるNotchシグナルの意義解明:作製したSox2-CreER;NICDfloxedマウス、Sox2-CreER;Hes1floxedマウスを用いて、タモキシフェン誘導性CreによるNotchシグナルのgain of function実験、loss of function実験を行い、食道―胃接合部形成/維持におけるNotchシグナルの意義を解明する。マウス実験で何らかのフェノタイプを得られた場合、交配したマウス受精卵からES細胞を樹立し、in vitroでのオルガノイド作製を行い、タモキシフェン投与によって食道―胃都合部形成過程におけるNotchシグナルの関与メカニズムの詳細に迫る方針。 3)オルガノイド作製技術を用いた試験管内胃がんモデルの作製:Sox2-CreER;Apcfloxedマウスから樹立したES細胞を用いて、オルガノイド作製、タモキシフェン投与による試験管内胃がんモデルの開発に着手する。
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