| 研究課題/領域番号 |
26253069
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
川口 義弥 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (60359792)
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| 研究分担者 |
山田 泰広 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (70313872)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 食道 / 胃 / ES細胞 / オルガノイド |
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| 研究実績の概要 |
１）レポーターES細胞を用いたRainbow Organoid作製による食道―胃分化制御機構の解明：Sox2/GATA4発現パターンによる食道／胃運命制御機構を想定した。新たにGata4-CreERT2;ROSA26rマウスを作成し、発生時期特異的lineage tracingによって発生初期(e7.5～e11.5)にそれぞれの転写因子を発現している細胞が、最終的に食道・胃のどちらに寄与できるかを調べた。その結果、胎生7.5日から8.5日間のわずか1日間に食道と胃の運命決定が決定しており、Sox2とGata4の発現パターンで区画化できることを証明した。
そこで、Sox2/GATA4ダブルレポーターES細胞を用いたin vitro分化誘導系での検証を加えた。内胚葉上皮(Gata4+)を分化誘導後、培養2-3日のうちにSox2陽性細胞群とSox2/GATA4共陽性細胞群に分かれることが分かった。この段階（通常発生の8.5日に相当）でSox2陽性細胞、Sox2/GATA4陽性細胞、GATA4陽性細胞をFACS分取して培養すると、各々食道、胃、十二指腸オルガノイドとなった。つまり、in vivoのlineage tracing結果と矛盾なくin vitro分化誘導系においてもSox2/GATA4発現パターンで将来の食道／胃への運命決定がなされると証明された。
2) 食道―胃接合部形成／維持におけるNotchシグナルの意義解明：計画通りSox2-CreER;Hes1floxedマウスに胎生8.5～11.5日のどの時期にTamoxifenを投与しても、食道上皮の菲薄化、胃腺上皮における分泌系細胞(内分泌細胞や胃酸産生細胞)数の増加というフェノタイプが観察されたが、食道・胃接合部の境界破綻はきたさなかった。一旦食道への運命決定がなされた後の境界維持にはNotchは必須でないと結論された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度の研究成果で、食道―胃の運命決定の時期が、通常発生ではe7.5-e8.5の間のわずか1日で起こっていること、in vitroでの内胚葉上皮(Gata4+)から食道前駆細胞(Sox2+)、胃前駆細胞(Sox2+Gata4+)への運命分岐は培養2-3日間で起こることがほぼ確実となった。現在、in vitro実験によるGATA4/Sox2発現制御機構の解明を目指している。発生におけるe8.5の前腸細胞は一列に配列しており食道、胃それぞれの前駆細胞は長軸方向にはわずか数個の幅で構成されている。これまでのin vitro実験結果からは、前後軸を制御するmorphogen濃度勾配だけでは領域化は規定できない可能性が高い。in vitroでe7.5に相当する段階の細胞をFACS 分取してもそれだけでは細胞塊形成能力がないことから、問題の24時間の間に何らかの細胞間相互作用が新たに成立していることを伺わせる。
上記、重要な知見は得ているが、予定していた試験管内発がんモデルの作成と解析が遅れており、全体的な達成度はやや遅れていると自己評価する。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）トリプルレポーターES細胞によるRainbow Mouse, Rainbow Organoidを用いた食道／胃分化制御機構の解明：
本研究の最大の強みは、ダブルレポーターES細胞を用いたin vitro分化誘導によるRainbow Organoid解析と、同一ES細胞を用いたマウス解析を並行して解析可能な点にある。理論的にはマーカー遺伝子の発現量はin vitroとin vivoで全く同一になるはずであり、FACS gatingも同一となることになる。つまり、in vitro培養2-3日間、in vivo発生過程e7.5-e8.5の２４時間で起こる変化をin vitro、in vivoの両方から正確にFACS分取し、それを材料にGATA4並びにSox2の発現制御機構を解明する。
２）食道―胃接合部形成／維持におけるNotchシグナルの意義解明：GATA4-CreER;NICDfloxedマウス、GATA4-CreER;Hes1floxedマウスを用いて、胎生7.5日のタモキシフェン投与によるNotchシグナルのgain of function実験、loss of function実験を行い、食道―胃接合部形成におけるNotchシグナルの意義を解明する。
３）オルガノイド作製技術を用いた試験管内胃がんモデルの作製：Sox2-CreER;Apcfloxedマウスから樹立したES細胞を用いて、オルガノイド作製、タモキシフェン投与による試験管内胃がんモデルの開発を進める。
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