| 研究課題/領域番号 |
26282135
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
石原 一彦 東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90193341)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | バイオマテリアル / 細胞・組織 / ES細胞 / ハイドロゲル / 分化誘導 |
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| 研究実績の概要 |
細胞増殖の周期を能動的に調節することを基本とし、同じタイミングですべての細胞を分化誘導する方法の提案とその細胞機能評価、細胞応答機序の解明を実施する。細胞応答を誘起する重要な要因が、細胞の擬似的な細密状態の構築であると考え、ハイドロゲルの力学的特性及び溶質拡散性より実証する。
平成26年度は、優れた細胞親和性を有するリン脂質ポリマー、Poly(2-methacryloyloxyethyl phospholylcholine-co-n-butyl methacrylate(BMA)-co-4-vinylphenylboronic acid) (PMBV)とPoly(vinyl alcohol) (PVA)をベースポリマーとして考え、これらのポリマーの細胞培養媒体中で生じる自発的複合体形成反応により可逆解離型ハイドロゲルを形成した。このハイドロゲルは、含水率が高く、良好な光学特性を有することから、細胞の情報あるいは細胞内の分子に関連する情報をin situで取り出すことが可能であることを見いだした。これより細胞の情報を連続的にモニタリングし、細胞の性質・機能の検出をすることが可能であった。このハイドロゲルはこれまでハイドロゲルを解離させる際に、グルコースを添加していたが、PMBVとの結合定数を決定し、最終的にD-sorbitolの単糖の添加により、30分間以内に可逆的に解離させることができた。さらにPMBV/PVAハイドロゲルの細胞親和性を確認し、細胞外マトリックスに近い力学的特性(0.5kPa～1.5kPaの弾性率)になるように調節することが可能となった。これにより内包した細胞の性質を制御する可能性を示唆した。特に、骨細胞に分化するES細胞を内包させて、細胞周期をそろえることに成功するとともに、分化誘導因子を加えることで、骨細胞への分化誘導効率が約３倍となることを見いだした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
細胞親和性が高く、室温にて細胞培養培地とともに細胞を固定化できるハイドロゲル担体の創製に成功し、これを基礎としてES細胞の細胞周期をそろえることに成功している。細胞をハイドロゲル中に包埋固定すると、凍結することなく室温下にて１週間以上保存できることを見いだした。その際に、人工細胞外マトリックスとしての機能を発現し、その力学的特性により細胞周期のon-offを制御できることを世界で初めて見いだした。また、このハイドロゲルが透明であることから、従来の蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡の使用ができるとともに、溶質拡散性も担保できていることが認められた。ハイドロゲル内に包埋され、一晩保存されることで、細胞周期の調整ができ、最高で90％程度が休止期になることを見いだしている。これまでこのような現象は、細胞密度を高めた培養のいわゆろ接触阻害にのみ認められている現象である。また、細胞に影響する薬剤の使用も不要なことから、全く新しい細胞機能調整法の確立が達成できた。ハイドロゲルを解離させ、分化誘導をした細胞を温和な条件で、活性を維持したまま回収する条件もめどが立ってきている。これまでの細胞培養系と比較して、約３倍となる分化誘導効率を実現することに成功し、今後のES細胞を利用した細胞工学に新しいプロセスを提供することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ハイドロゲル内に包埋される細胞の細胞周期に注目して、細胞の休止期(G0,G1相)に存在する細胞組成を99%以上にし、より単一状態に近い細胞を確保できるようにする。一般的に細胞培養皿にて培養する場合には、休止期には約50%が存在するが、倍加時間の短い細胞では、さらにこの組成が低下する。遺伝子導入や生理活性分子により細胞を分化させようとする場合には、この休止期に存在する細胞が主に影響を受ける。したがって、この組成を高めることは極めて重要な技術となる。また、細胞塊の状況を観察しながら、休止期(G0,G1相)に存在するES細胞に対して、生理活性分子を添加して細胞の分化誘導を行う。モデル細胞としては、マウス間葉系幹細胞(C3H10T1/2)を利用し、Bone Morphogenetic Protein(BMP)-2による骨組織への分化を考察する（Ishihara, Biomed Mater 2010）。分化誘導マーカーとしては、Type II collagenの生成をELISAにより定量し、休止期に存在する細胞組成と分化誘導効率との関連性を求める。一方、人工の細胞外マトリックス中に固定化されて、その活動を制限されているために、細胞に対して分化誘導シグナルが入っていても、誘導が認められない場合が考えられる、そこで、実際のType II collagenの生成量のみならず、発現に関連するmRNAの分析についてもReal-time PCR法を応用して同時に行う。この手法を確立し、順次対象とするES細胞種を増やすとともに、異なる細胞種に対して特異的な細胞内包ハイドロゲルの創製に展開する。ES細胞がより効率よく分化誘導される環境について理解・考察するとともに、幅広い細胞種に対応できるポリマー分子設計概念の提案に結実させる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
細胞親和型ポリマーハイドロゲルの調製に利用するポリマーの選定で、ブラック型などの構造明確なポリマーが必要と考えていたが、通常のランダムポリマーの特性が比較的良好で、内包する細胞の機能制御に進むことができた。そのために、平成２６年度は合成するポリマーの種類が少なくてすんだため、一部、予算を次年度に使用することとなった。一部、ブロック型ポリマーの合成に関しては合成を行ってているが、小規模のスケールであるために、モノマー、試薬、溶媒などの使用量が少なくなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
すでに、リビングラジカル重合に関しては合成を進めており、今後これをゲルとしての評価を行うために、３０ｇー５０ｇスケールにて大量合成する。その際には、モノマー、溶媒などが多量に必要となるために、平成２７年度に使用することとする。
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