| 研究課題/領域番号 |
26282215
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
堀 雄一郎 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00444563)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | PYPタグ / 発蛍光プローブ / DNAメチル化 |
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| 研究実績の概要 |
DNAのメチル化は、遺伝子発現抑制のための重要な化学修飾であり、その異常は、様々な疾患の原因となることから、DNAメチル化検出技術の開発は、生命科学や医学の分野で重要な課題である。生細胞のままDNAメチル化を検出する技術は、蛍光蛋白質を用いた方法に限られており、メチル化DNAに結合するMBDという蛋白質ドメインを蛍光蛋白質に融合させ、その局在を観察するものである。しかしながら、遊離の融合蛋白質からも蛍光が観測されることが問題であった。
本研究では、この問題を解決するために、PYPタグラベル化技術を応用し、メチル化DNAに結合した時に初めて蛍光強度を増大させる革新的な化学プローブの開発に取り組んだ。まず、DNAに結合すると蛍光性となる色素でMBDをラベル化する。この際に、PYPタグをMBDに融合させ、PYPタグラベル化技術によりMBDをDNA結合色素でラベル化する。DNA結合色素としては、オキサゾールイエロー（YO）を選んだ。MBDがメチル化DNAに結合すると、YOがDNA近傍に配置される。YOは、その近接効果により、DNAに結合し蛍光強度を上昇させる。YOは、元来DNA結合親和性が低いため、MBDによる近接効果がなければ、非特異的にDNAに結合することはないと考えた。実際に、YOを持つラベル化分子を合成した。このラベル化分子とPYPタグ融合MBDのラベル化反応を行ったところ、複合体形成を示す吸収スペクトルが得られた。更に、このラベル化体とDNAを反応させ、ゲルシフトアッセイを行ったところ、選択的にメチル化DNAに結合することが示された。更に、蛍光測定を行った結果、ラベル化体は、メチル化DNAに結合すると蛍光強度を上昇させることが示された。以上の結果から、PYPタグラベル化技術を応用し、メチル化DNAに結合し蛍光強度を上昇させる化学プローブの開発に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
メチル化DNAを検出する技術として、メチル化DNAに結合すると蛍光強度が上昇するプローブを開発することが当初の目的であった。前年度までに取り組んだ蛋白質ラベル化技術を応用することで、当初の目的が達成された。生化学・分光学実験も実施し、メチル化DNAを検出することができることが明らかとなった。このように、本研究計画は、概ね順調に達成されているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究において、PYPタグラベル化法を用いることで、試験管レベルでMBDをDNA結合色素で標識し、小分子・蛋白質ハイブリッドプローブを構築することに成功した。更に、このプローブとメチル化DNAを反応させると、プローブの蛍光強度が上昇した。今後は、ラベル化反応を生細胞内で実施し、小分子・蛋白質ハイブリッドプローブを構築する。また、内在性のメチル化DNAをそのハイブリッドプローブにより、生細胞で検出しイメージングする実験に取り組む。更には、メチル化阻害剤を添加し、細胞内から得られる蛍光シグナルが、メチル化DNAに由来するかを検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
PYPタグの表面電荷がメチル化DNA結合能やメチル化DNAに結合した時の蛍光強度増大度に影響を与えることが示唆される結果が生じた。蛍光強度増大度は、生細胞イメージングの成否に関わるものであり、PYPタグの表面電荷を変える変異体を用いた実験を新たに行う必要性が生じた。このため、次年度の実験経費が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度の使用計画は、以下のとおりである。プローブの合成のための有機合成試薬の購入経費を585,369円、変異体を用いた実験のための生化学試薬の購入経費を500,000円、細胞生物学実験の試薬の購入経費を500,000円とした。
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