| 研究課題/領域番号 |
26282219
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
古田 寿昭 東邦大学, 理学部, 教授 (90231571)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ケージド化合物 / 遺伝子発現 / DNA / PCR |
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| 研究実績の概要 |
モデル生物個体内の狙った細胞で，狙った時期に，任意の遺伝子の機能発現と機能阻害を達成する手法の開発を目指して研究を進めた。平成26年度は，ケージドプラスミドDNAを調製する方法を確立するため，ケージドプライマーの開発と修飾位置特異的ケージドプラスミドDNAの合成を目的にした。以下の2通りの方法で2種類のケージドプライマーを調製した。１つ目は，核酸塩基に光分解性保護基を導入したモノマーを合成して固相合成に利用する方法で，5’端から6番目のグアニンの6位にBmc基を導入した33-mer DNAの合成に成功した。合成したケージド33-mer DNAをプライマーの一方に，3 kbpのプラスミドDNAをテンプレートに用いてPCRを行い，1か所の塩基がケージンググループで修飾された全長のプラスミドDNAの直鎖状コピーが調製可能であることを示した。2つ目の方法は，あらかじめ合成した短鎖DNAをケージング試薬で修飾する方法で，化学合成した33-mer DNAのリン酸部位をBio-Bhc基で修飾したケージドプライマーを合成した。この段階では未修飾DNAが混在しているが，そのままPCRのプライマーとして利用して，3 kbpのプラスミドDNAの全長コピーを調製した。得られたPCR産物から，プライマーに設定した領域がBio-Bhc基でケージングされたDNAを精製できること，ケージングの有無を電気泳動で検出できることも確認した。
また，遺伝子の機能発現を光制御する別法として，アンチセンスおよびアンチジーン作用が期待されるペプチド核酸（PNA）のケージド化合物を合成する方法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り，ケージドプライマーの化学合成と，それを用いるlong PCR法によって，修飾領域を選択して長鎖DNAのケージド化合物を調製する方法を開発することができた。この方法で調製したケージドDNAは，プライマーに設定した領域内にケージンググループを持つ。プライマー領域は自由に選択することができるので，任意の領域の核酸塩基またはバックボーンのリン酸部位を修飾したケージドプラスミドDNAの調製が可能になった。さらに，1光子および2光子励起下で高い光反応性を持つと期待されるケージドペプチド核酸の合成法を確立し，遺伝子の機能発現を光制御する方法のレパートリーを広げることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ケージドプラスミドDNAを用いて，光照射によって効率の良い遺伝子発現を実現するためには，光照射前に完全に転写活性が止まっていることが望ましい。そこで，プロモーター領域，TATA box，転写開始点近傍，コード領域等に相当する塩基配列のケージドプライマーを合成し，いずれが最適かを検討する。モデル生物個体中で遺伝子発現の光制御を容易にするため，長波長光で光活性化できる光分解性保護基の開発を並行して進める。すでに，数種類の候補化合物を見出しているので，これらを化学修飾して，ケージドDNA合成に利用可能であるか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
合成した化合物の化学的性質の解析に使用しているHPLCシステム関連の消耗品の使用量，および，修飾DNAの受託合成費が，当初予定より少ない量で実施可能であったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度の計画に従って，新規化合物の化学的性質の解析に係る消耗品費，および，修飾DNAとペプチド核酸誘導体の受託合成費として使用する。
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