| 研究課題/領域番号 |
26288071
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
水谷 文雄 兵庫県立大学, 物質理学研究科, 教授 (80118603)
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| 研究分担者 |
安川 智之 兵庫県立大学, 物質理学研究科, 准教授 (40361167)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ゲル粒子 / 高感度免疫アッセイ / 酵素 / 電解酸化 / 誘電泳動 / 化学増幅 |
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| 研究実績の概要 |
初年度は，迅速，簡便および検出感度の向上をキーワードとした免疫測定デバイスの開発に必要な要素技術について基礎特性調査を行った．特に，「酵素内包アルギン酸ゲル粒子の開発」を重点的に進めた．
1）電気化学制御型の酵素内包アルギン酸ゲル粒子作製：25万個のマイクロホールを有する電極アレイを用い，酵素内包型アルギン酸ゲル粒子を作製した．銅電極基板上にマイクロホールアレイを作製し，定電流電解法を用いて金属銅を酸化し銅イオンを生成させた．溶液中のアルギン酸Naがマイクロホールから生成された2価カチオンである銅イオンの生成によりゲル化しゲル粒子を作製することができた．均一粒径のゲル粒子を迅速（数秒～数分）で大量一括に作製できた．生成されるゲル粒子の粒径は，電解時間および電解電流を制御することにより50-200ミクロン程度であった．さらに，溶液にグルコース酸化酵素（GOx）を添加しておくことにより，酵素を内包したゲル粒子の作製が可能であった．
2）サイクリング法と変換蓄積法による酵素反応生成物の高感度計測：電極にGOxを固定化しグルコースおよびメディエータ（4-アミノフェノール）存在下でアンペロメトリーを行い，酵素レドックスサイクリングによりシグナルを増幅させた．この際，対極で銅イオンの還元反応を進行させて金属銅を析出させ，ストリッピング法による電解酸化でシグナル増幅を行った．これにより，通常のアンペロメトリー法の1,000倍に相当するnMレベルの4-アミノフェノールの検出を可能にした．この手法を免疫測定法に応用し，pMレベルの測定対象物質を検出可能であることを示した．
3）誘電泳動による微粒子の免疫捕捉：誘電泳動を用いたマイクロウェルアレイ内への粒子の誘導と免疫反応による粒子の捕捉を行った．粒子は約10秒でウェル内へと誘導され，免疫反応により捕捉された粒子をウェル内にとどまらせることができた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
初年度に予定していた研究実施項目をすべて遂行することができ，当初予定を上回る成果を得ることができたため，「当初の計画以上に進展している」と評価した．ゲル粒子の作製では，電気化学的に粒径の均一な粒子を数分と極めて迅速に大量一括作製できた．また，電解時間および電解電流の制御により作製される粒子の粒径をコントロールできた．また，グルコース酸化酵素をゲル粒子内に内包することも可能であった．また，高感度な酵素反応生成物の電気化学計測では，酵素レドックスサイクリングと金属銅への変換蓄積法を組み合わせ，通常のアンペロメトリーの1,000倍の感度に相当するnMレベルの酵素反応生成物を検出可能にした．また，交互くし型マイクロ電極アレイを用いた電気化学レドックスサイクリングによるシグナル増幅法についての検討も遂行できた．さらに，サイクリング法と変換蓄積法を組み合わせた増幅システムを免疫測定に適用し，pMオーダーのがんマーカー（CEA）を検出できることを示した．平成27年度に計画していた，正の誘電泳動による微粒子のマイクロウェルアレイ電極内への迅速な誘導，免疫反応による捕捉，負の誘電泳動による未反応粒子の除去についての検討を早期開始し，その可能性についてポジティブな結果を得ることができた．以上より，当初計画にある項目をすべて遂行し，予想を上回る成果を挙げられたことと，次年度以降に予定していた項目について研究を前倒しして開始し良好な結果が得られていることから，本研究は当初の計画以上に進展していると言える．
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年は，初年度に得られた成果をブラッシュアップするとともに，項目3の誘電泳動を用いた迅速，簡便な免疫計測法の開発を行い，各項目の融合を積極的に推し進める．
ゲル粒子作製においては，初年度に作製したマイクロウェルアレイ電極を銅イオンの供給源として利用し，電解酸化溶出により銅イオンをウェルアレイ内に生成させてウェルアレイ内のアルギン酸Naをゲル化させる．電極サイズ，電解時間および電解電流に対する生成ゲル粒子形状を調査し，数ミクロンオーダーの粒子を大量一括に生成できる条件を確立する．グルコース酸化酵素または西洋わさびペルオキシダーゼを内包したゲル粒子を作製し，酵素内包量，活性および基質透過性の評価を行う．ゲル粒子からの酵素の脱離を抑制するために，酵素を結合させたポリリシン等のカチオン性高分子を混合してゲル粒子を作製する．高分子化と静電相互作用（リシンの-NH3+とアルギン酸Naの-COO-）によるポリイオンコンプレックス効果により，ゲルの硬化性の向上と酵素脱離の抑制を達成する．同様の手法でゲル粒子に抗体修飾を行う．
誘電泳動を用いて初年度に作製した酵素内包ゲル粒子を迅速（数秒）に抗体固定化領域に集積化し，抗原の存在下で迅速（1分）で免疫捕捉する技術を開発する．まず，印加する交流電圧の周波数および粒子懸濁液の導電率を制御し，粒子の誘電泳動挙動を詳細に調査する．次に，誘電泳動による酵素内包型ゲル粒子の免疫捕捉を行う．抗体修飾ゲル粒子を用いて抗体固定化孔への誘導と免疫捕捉を行う．十分な抗原の存在下，ゲル粒子を孔内に誘導して数分間その状態を保持して免疫捕捉する．その後，未反応の粒子を孔から排除する．混合する抗原濃度と捕捉率の関係を調査し，誘電泳動法の測定領域を把握する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
備品として光学顕微鏡を購入したが、当初予定額と比較して安価に購入することができたため。当初予定以上のデバイスの小型化に成功し、使用する試薬量を低減できたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
マイクロウェル内に生成した個々の粒子を高倍率観測するために、初年度に購入した顕微鏡用の高倍率対物レンズ（40倍）を購入する。
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